竹节香附素A 对肝缺血再灌注大鼠的保护作用机制

李洪波，黄 锐，代 将，钟振东

（1. 四川省广汉市人民医院外二科，广汉 618300；2. 四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆外科，成都 610007；3. 四川省医学科学院·四川省人民医院急救中心，成都 610007；4. 四川省医学科学院·四川省人民医院动物研究中心，成都 610007）

近年来，肝病发病率逐年上升。据不完全统计，世界上多达2 5% 的人口有肝病，主要诱发类型包括病毒性感染、酗酒和非酒精性脂肪肝[1]。肝病后期的主要治疗手段是肝脏手术或肝移植手术，而肝缺血再灌注（hepatic ischemia reperfusion，HIR）则是手术必要环节。目前，肝缺血再灌注的主要损伤为缺氧造成的器官损伤、炎性反应、细胞过度凋亡和基因突变等，因此，如何预防与治疗此类损伤已经是全球性课题[2]。

竹节香附素A（raddeanin A, RA）是从海葵根中提取的夹竹桃型三萜皂苷[3]。研究发现RA对人类肝癌细胞具有抗增殖[3]、促凋亡、抑制迁移与侵袭的效果。另外，RA 已被证实能通过抑制核因子-κB 和Wnt/β-catenin 信号通路，引起结直肠癌细胞凋亡[4]，但至今未见RA 在预防肝缺血再灌注损伤中的相关报道。此外，RA 参与PI3K/AKT/mTOR 通路诱导乳腺癌细胞凋亡[4]，提示RA能在细胞凋亡通路中起调节作用，可能是预防肝缺血再灌注后肝细胞过度凋亡的一个潜在化合物。因此，本实验从氧化应激与细胞凋亡两个方面探讨RA 对肝缺血再灌注损伤大鼠的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠，体质量为260±20 g，由成都达硕实验动物有限公司提供[SCXK（川）2015-030]，饲养于四川大学华西医院[SYXK(川)2018-119]。本研究经四川大学华西医院实验动物伦理委员会审批通过（编号2020280A）。

1.2 药物、试剂和仪器

RA 纯度≥98%，购自上海源叶生物科技有限公司（批号：20190203）。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、TUNEL 测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗B 淋巴细胞瘤-2 相关X 蛋白（Bax）、B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、β-肌动蛋白（βactin）一抗和羊抗兔二抗均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter 公司）、酶标仪（美国Thermo 公司）、切片机（德国Le i c a 公司）、光学显微镜（日本Olympus 公司）、蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad 公司）、全功能成像仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 主要实验方法

1.3.1 实验分组及大鼠肝缺血再灌注模型构建[5]

将30只大鼠按随机数字表法随机分成3组，即模型组、假手术组与RA 组，每组10 只。RA 组手术前24 h 与1 h 分别经尾静脉注射RA（10 mg/kg），模型组与假手术组同法注射等体积的0.9% NaCl溶液（生理盐水）。最后一次预处理完毕后1 h，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg），于上腹正中做长约4 cm 切口打开腹腔，暴露肝脏且游离肝周韧带。模型组与RA 组用无损伤血管夹夹闭肝左叶和肝中叶入肝血管阻断血流（70%肝脏缺血）60 min 后，松开血管夹恢复血流。假手术组仅游离肝门而不阻断血流。再灌注6h 后，从下腔静脉采血用于丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（A S T）、乳酸脱氢酶（L D H）的检测；采集左叶肝脏在－80℃下储存，用于炎性因子、氧化应激因子和凋亡相关蛋白的检测；右叶肝脏储存在4% 的多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色与TUNEL 染色病理学观察。

1.3.2 血清中ALT、AST、LDH 含量的检测

收集下腔静脉血1 mL，以3 000 r/min 离心10 min，取上层血清，按照试剂盒说明书进行操作，使用全自动血液生化仪测定各组血清中ALT、AST 和LDH 的水平。

1.3.3 肝脏中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA含量的检测

将左叶肝脏制备10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书进行操作，使用全自动酶标仪测定肝脏中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA 的含量。

1.3.4 肝脏形态学分析

所有组织病理学检查均采用“双盲法”。将固定好的各组肝脏标本用石蜡包埋后分别使用HE染色，在400 倍下进行组织学分析，评价肝脏组织被膜、肝索、中央静脉和核膜等的损伤情况。

1.3.5 肝细胞凋亡率的检测

各组肝脏标本用石蜡包埋、切片后，按照TUNEL染色试剂盒进行染色操作，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，每张切片随机选取5个400倍视野，按每100 个细胞中含凋亡细胞数计算细胞凋亡率。

1.3.6 蛋白质印迹法检测

将左叶肝脏取出，提取总蛋白并测定蛋白浓度。蛋白样品（20µg）使用10 % SDS-PAGE进行电泳，然后转移到PVDF 膜上。在室温下用5%脱脂奶粉将膜封闭60 min，然后加入下列一抗在4 ℃条件下过夜孵育：兔抗大鼠B a x（1 ∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2（1∶1 000）、兔抗大鼠Caspase-3（1∶1 000）、兔抗大鼠β-actin（1∶1 000）。使用TBST 将膜清洗干净后，加入羊抗兔IgG（1∶1 0000），室温孵育2 h，最后使用ECL试剂盒曝光显影，使用凝胶成像系统进行分析。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 RA 预处理对大鼠肝脏功能的保护作用

再灌注6 h 后，与假手术组相比，模型组与RA 组血清中ALT、AST 与LDH 含量明显增高（P＜0.01）。与模型组相比，RA 组血清中ALT、AST 与LDH 的含量明显减少（P＜0.01）（表1）。

2.2 RA 预处理对大鼠炎性因子的影响

再灌注6 h 后，与假手术组相比，模型组大鼠肝脏中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量明显增多（P＜0.01）；与模型组相比，RA 组肝脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明显减少（P＜0.05）（表2）。

2.3 RA 预处理对大鼠肝脏氧化应激因子的影响

再灌注6 h 后，与假手术组相比，模型组大鼠肝脏中SOD 含量明显降低，MDA 含量明显增多（均P＜0.0 5）；与模型组相比，R A 组肝脏中SOD 含量明显增多，MDA 明显减少（均P＜0.05）（表3）。

表 1 3 组大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 1 3 组大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：与假手术组相比，**P ＜0.01；与模型组相比，##P ＜0.01。

组 别 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)假手术组模型组竹节香附素A 组45.83±5.95 199.50±15.24**129.87±14.88##110.67±5.68 203.67±11.02**166.67±6.72##791.53±21.33 1717.57±75.74**1347.23±34.36##

表 2 3 组大鼠肝脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 2 3 组大鼠肝脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：与假手术组相比，**P ＜0.01；与模型组相比，##P ＜0.01。

组 别 IL-1β/(ng·L-1) IL-6/(ng·L-1) TNF-α/(ng·L-1)假手术组模型组竹节香附素A 组4.55±0.21 5.28±0.14**4.82±0.16##3.58±0.11 3.99±0.13**3.70±0.10##35.96±1.47 40.36±0.66**37.99±0.30##

表 3 3 组大鼠肝脏中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 3 3 组大鼠肝脏中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：与假手术组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组相比，#P ＜0.05。

组 别 SOD/(ng·L-1) MDA/(ng·L-1)假手术组模型组竹节香附素A 组22.97±1.08 20.47±0.14*21.13±0.32#0.73±0.02 0.84±0.02**0.79±0.02#

2.4 RA 预处理对大鼠肝脏形态学的影响

HE 染色后光学显微镜下观察发现：假手术组肝脏组织均为正常形态结构，未见明显的纤维组织增生及炎性渗出（图1A）。模型组肝脏被膜完整，肝索排列紊乱；大量肝细胞空泡变性或坏死，可见细胞明显肿胀变形，细胞质内含大小不等的空泡，细胞核多被挤于一侧，部分细胞核固缩或溶解，细胞结构模糊；门管区结构完整，未见明显病理改变（图1B）。RA 组肝脏被膜完整，肝索排列较为整齐，肝细胞肿胀、空泡变性，偶见少量肝细胞呈点状坏死，并伴少量中性粒细胞或淋巴细胞浸润；门管区结构完整，未见明显病理改变（图1 C）。

图 1 3组大鼠肝脏病理形态学观察 (HE染色)Figure 1 Observation on pathological morphology of the liver in the three groups of rats (HE staining)

图 2 3组大鼠肝细胞凋亡观察 (TUNEL染色)Figure 2 Observation on apoptosis of hepatocytes of the three groups of rats (TUNEL staining)

2.5 RA 预处理对大鼠肝脏细胞凋亡的影响

TUNEL 法结果显示，假手术组细胞核多数呈蓝色，细胞结构完整，凋亡细胞较少（图2A）；模型组大部分细胞核呈黄色，说明细胞结构被破坏，凋亡细胞大量生成（图2B）；RA组细胞核大部分呈蓝色，部分细胞核呈黄色，说明出现部分凋亡细胞（图2C）。与假手术组相比，模型组和RA 组肝脏细胞凋亡率均明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，RA 组肝脏细胞凋亡率明显降低（P＜0.0 1）（表4）。

2.6 RA 预处理对大鼠肝脏凋亡蛋白的影响

与假手术组相比，模型组与RA 组中Bax 与Caspase-3 的蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2 的蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）；与模型组相比，RA 组中Bax 与Caspase-3 的表达水平明显降低，Bcl-2 的表达水平明显升高（P＜0.05）（表5，图3）。

表 4 3 组大鼠肝细胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 4 3 组大鼠肝细胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：与假手术组相比，**P ＜0.01；与模型组相比，##P ＜0.01。

组 别 凋亡率/%假手术组模型组竹节香附素A 组0.02±0.04 16.15±0.33**6.62±0.99##

表 5 3 组大鼠肝脏中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表达Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 5 3 组大鼠肝脏中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表达Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：与假手术组相比，**P ＜0.01；与模型组相比，#P ＜0.05，##P<0.01。

组 别 Bax Bcl-2 Caspase-3假手术组模型组竹节香附素A 组1.00±0.00 2.43±0.33**1.81±0.11##1.00±0.00 0.54±0.12**0.77±0.14#1.00±0.00 1.61±0.17**1.23±0.05##

图 3 3 组大鼠肝脏中Bax、Bcl-2、Caspase-3 表达Figure 3 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats

3 讨论

肝缺血再灌注损伤最主要的特征是肝损伤，而肝功能检测是目前肝损伤检测最快捷方便的一个方法，其最常见的检测指标为血清中的ALT、AST和LDH。肝损伤的主要表现是血清中ALT和AST 的水平异常升高[6-7]。本研究结果显示，RA 能有效降低肝缺血再灌注后肝细胞中ALT与AST的水平，同时能降低血清中LDH 的水平（P＜0.01），说明模型制备成功，而且RA 能预防肝缺血再灌注后肝细胞的损伤。

氧化应激平衡在缺血过程中起关键作用，失衡会导致肝细胞损伤[8]，主要原因是缺血导致组织缺氧，形成大量氧自由基，发生脂质过氧化作用[9-10]。目前检测氧化应激平衡的常用指标为SOD 与MDA。本研究结果表明，肝缺血再灌注前使用RA 预防给药，能明显降低肝组织中MDA的含量，提高SOD 的水平（P＜0.05），说明RA 能预防肝缺血再灌注带来的氧化应激失衡。有研究发现，肝脏中的巨噬细胞会在再灌注后产生大量的炎性因子与趋化因子，调节与激活一系列的炎性机制，造成炎性反应，损伤肝细胞[11]，最终引起细胞死亡和组织坏死[12]。同时，再灌注早期主要的损伤是由促炎因子与细胞因子造成，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等[13]。本实验发现，术前使用RA 预防后，肝脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量显著降低（P ＜0.05），阻止了肝组织氧化应激失衡，同时减轻了炎性因子对肝脏的损伤。

病理学观察是评价器官病变的重要手段之一，能直观地反映器官组织的状态。对肝脏进行病理学形态观察也发现，HE 染色后，RA 组肝脏组织的细胞核肿胀程度与细胞质内空白均明显减少，细胞排列结构也恢复整齐，证明RA 可以预防肝缺血再灌注后的损伤。细胞凋亡是一种细胞死亡方式。研究发现，肝脏再灌注会激活相关凋亡通路，诱导正常或受损的肝细胞死亡[14]。本实验发现，RA 组中肝细胞的凋亡数量明显减少，细胞凋亡率也明显降低（P ＜0.01）；RA 组凋亡通路中Bax 和Caspase-3 的蛋白表达水平显著降低，Bcl-2 的表达水平显著升高（P ＜0.05），结果表明，RA 在作用正常肝细胞时，体现的药理作用主要以抗炎抗氧化为主，通过减少肝脏组织中氧化应激与炎性因子的水平间接避免肝脏细胞受损，表现出细胞凋亡减少的状态。综合两部分结果，RA 的预防给药能减轻肝脏的病变，减少肝细胞的凋亡数量，其作用机制可能是降低Bax 和Caspase-3 的表达，以及增加Bcl-2 的表达。

缺血再灌注是一种复杂的病理生理现象，是一个包括局部缺血损伤与再灌注损伤的动态过程[15]，涉及代谢紊乱、氧化应激、炎性反应和细胞凋亡等过程。所以，探讨缺血再灌注损伤的确切机制对减轻手术风险和改善患者预后具有重要意义。RA 作为一种中药有效提取成分，提取方法简单，成本低廉且获取方式多，不良反应少，是一种非常好的治疗药物。RA 在肿瘤细胞中通过促进细胞凋亡产生抗肿瘤的作用，对正常细胞具有保护与抗炎作用，不会对正常细胞造成损伤。本实验通过对大鼠术前注射RA，研究发现其有预防肝缺血再灌注损伤的效果，表现为提升肝功能、降低氧化损伤、减少炎性因子的释放，以及减少肝细胞凋亡，其作用途径可能与Bax/Bcl-2/Caspase-3 凋亡通路相关。