实验材料检测在SPF 级实验小鼠质量控制中的应用

陈国元，康 康，李晓娴，纪文韬，张金梅，冯延花，田倩莹，吴宝金

（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台，上海 200031）

屏障设施作为SPF 级实验动物饲养繁殖和动物实验的主要场地，其日常运行的有效管理十分重要。屏障设施管理除了控制温度、湿度、光照及噪音等环境条件，最重要的目标就是将病原微生物和寄生虫等威胁动物健康的致病因子屏蔽在外[1]。屏障设施除了对标准中规定的各项参数进行控制外，还必须考虑其他因素对屏障内实验动物质量的影响，其中威胁最大的是实验过程中使用的各种各样的实验材料，尤其是那些在屏障外制备的、不允许经高压灭菌的生物活性物质和试剂。

自2013 年中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（现分子细胞科学卓越创新中心）的2 400 m2动物屏障设施启用至今，设施内饲养的实验小鼠始终保持SPF 级。在实际工作中，本单位重视对带入设施内实验材料的管理，进行了连续5 年的大规模检控工作，共检测了一万多份实验材料样品。现将本单位实验材料检控的措施和结果整理成文，以期对动物实验设施的有效管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 检测样品的获取

本研究涉及的检测样品仅为2015—2019 年实验人员带入本单位屏障设施的动物实验材料。根据本单位对屏障设施管理的规章制度要求，每一位实验人员在完成动物实验后将实验试剂或材料留样送检，溶液类样品体积要求尽量超过100 µL。针对溶液类样品和特殊饲料等非细胞类样品，检测其是否含带细菌；针对细胞类样品，则检测其有无支原体。

1.2 菌落检测方法

吸取100 µL 溶液类样品，涂布于直径9 cm无抗L B 平皿（上海科玛嘉微生物技术有限公司）；送样体积少于100 µL 时，使用无菌水补充体积至略超过100 µL，然后吸取100 µL 涂布于无抗LB 平皿。特殊饲料等固体样品，则取小块样品无菌操作捣碎后，使用200 µL 无菌水浸泡，室温稍微静置，再吸取100 µL 上清液涂布于无抗平皿。平皿在37 ℃培养箱中培养24 h 以上，检查有无菌落和菌落数量等。

1.3 支原体检测方法

吸取细胞类样品培养液上清1 000 µL，置于1.5 mL 的EP 管中，不足体积则用无菌水补足至1 000 µL。100 ℃加热EP 管10 min，然后以12 000 r/min 离心10 min。只移取上清液100 µL至新的EP 管，该上清液作为后续PCR 检测的样品。上清液样品于－20 ℃可保存1 周，于4 ℃只可保存1 d。

使用PCR 法检测上清液样品。PCR反应体系（共20µL）：2µL 待检测上清样品，10µL 2×EX Taq mix，0.5 µL 正向引物（序列：5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'），0.5 µL 反向引物（序列：5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'），7 µL 无菌去离子水。PCR 反应条件：94 ℃ 2 min，37 个循环（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），72 ℃10 min。PCR产物使用含EB 的2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为10 µL/孔。使用上海天能公司生产的Tanon 凝胶成像仪对电泳胶拍照记录，支原体阳性条带在270 bp 附近。

1.4 细菌鉴定方法

对非细胞类实验材料进行细菌检测时，如果涂布的LB 平皿出现阳性菌落，则从平皿中随机挑取菌落，用三线法划线接种到营养琼脂LB平板上，37 ℃继续培养24 h。再从该平皿挑取单克隆菌落，利用试剂盒（康为世纪生物技术有限公司）提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用细菌通用引物进行PCR 扩增，正向引物序列为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物序列为5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物序列位于细菌16S 核糖体RNA对应的DNA 编码区内。P C R 反应体系（共20µL）：2µL 样品，10 µL 2×EX Taq mix，0.5 µL 正向引物，0.5 µL 反向引物，7 µL 无菌去离子水。PCR 反应条件：94 ℃ 8 min，30 个循环（94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。PCR 产物送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果经BLAST比对后确定细菌种类。BLAST 使用的网站地址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

2 结果

2.1 样品收集情况

从2015 年开始，根据制定的设施管理规定，要求实验人员将带入的实验材料进行分样送检。在操作过程中，通过表格登记、传递仓监控、定期回溯有无人员漏送样品并加以提醒等措施，促使研究人员如实送检样品。送检的样品种类主要有化学和生物学试剂、麻醉剂、特殊饲料、细胞系、质粒、DNA 或RNA 等。5 年累计收检样品14 708 份，兽医实验室对所有样品进行了检测。表1 为2015—2019 年各种实验材料数量（包括非细胞类样品材料和细胞类样品材料）、收检样品分类和总量统计结果。从表1 可以看出，随着屏障内实验小鼠饲养量和动物实验量的逐年增加，实验人员按照要求送检的样品总量也逐年递增。

表 1 2015—2019 年收检样品分类和总量统计表Table 1 Classification and statistics for samples inspected from 2015 to 2019

2.2 非细胞类样品菌落检测结果

检测结果显示，约1/3 的样品无菌落生长，多数送检样品有一定量菌落生长。经过初期的比较权衡，将单个平皿菌落总数30 个作为控制标准，超过30 个菌落的样品判为细菌检测不合格，并通知实验人员处理所涉实验的动物。从表2 列出的统计结果可以看到，2015 年刚开始实施实验材料检控时，非细胞类样品细菌检测阳性率比较高。细菌阳性的样品数量和阳性率呈逐年下降趋势，近年来处在低于1%的检出率水平。图1 中的LB 平皿为典型的样品细菌检测出现阳性的结果，据送样的动物实验人员反馈，该试剂没有经过除菌处理。

图 1 LB平皿培养结果Figure 1 Results of a sample cultured on LB plate

表 2 非细胞类样品细菌检测统计Table 2 Statistics for bacterial detection in non-cellualr material samples

表 3 细胞类样品支原体检测统计表Table 3 Statistics for mycoplasma detection in cell samples

2.3 细胞类样品支原体检测结果

检测结果见表3。在2015 年送检的细胞样品中，支原体检出率高达13.5%。随着实验人员的重视，细胞样品的支原体检出率逐渐降低，2019年仅为1.52%。图2 显示PCR 法对5 个细胞样品的支原体检测结果的电泳图，其中泳道4～7 对应的4 个细胞样品未检测出支原体，泳道8 对应的1 个细胞样品支原体阳性。

图 2 细胞样品PCR法检测支原体电泳结果Figure 2 Results of electrophoresis of PCR products after mycoplasma detection in cell samples

2.4 实验材料中携带的细菌种类鉴定

为探究实验材料带入细菌的类型，2019 年选取了20 份细菌检测阳性样品，对样品中含有的细菌进行了鉴定。20 份样品共随机挑取了34 个单克隆菌落，提取相应基因组DNA，PCR 扩增后测序比对，从中鉴定出的细菌种类及数量见表4。样品携带细菌以葡萄球菌属的细菌居多；34 个单克隆菌落中，12 个为缓慢葡萄球菌，8 个为腐生葡萄球菌。

表 4 细菌类别鉴定结果Table 4 Results of identification of bacterial species

3 讨论

本单位动物屏障设施现保养有13 000 笼实验小鼠，至今持续运行已7 年多，设施内实验小鼠质量始终符合SPF等级标准要求，这与从2015 年开始进行大规模实验材料检控措施有密切关系。本单位规定研究人员向屏障内传递实验材料后，必须在屏障内将样品分装备检，同时提供课题组、实验人员姓名、样品名称、送检日期等信息。当细菌检测阳性或细胞支原体检测阳性时，兽医实验室会通知研究人员对实验材料制备过程进行整改，接触过阳性实验材料的小鼠须移出屏障设施。如果同一实验人员带入的实验材料在1 年内累计出现3 次阳性检测结果，则该实验人员不能在动物屏障设施内继续开展实验。该措施实行5 年来，检测的样品总量逐年增多，但细菌和支原体阳性的样品数量和阳性率均呈逐年下降趋势，说明对带入动物实验屏障设施内实验材料的检控措施有助于降低实验材料中微生物污染风险。

在做细胞培养时，实验人员会时刻注意无菌操作，但在做动物实验时往往疏于对材料的除菌处理，容易出现细菌或支原体污染。通过规则制定和配套检控措施，能使实验人员意识到控制实验材料中微生物的重要性并加以重视，可有效降低实验动物被污染的概率。一般实验材料可以通过高温消毒或滤膜过滤处理，一些不耐高温高压的材料可通过辐照除菌。实践中，须督促实验人员每次送检带入的实验材料样品。收到样品后须及时检测，如不能及时检测，需将样品放置4 ℃冰箱保藏，但不宜超过1 d，以防样品中细菌传代增量。

支原体是清洁级实验小鼠也必须排除的病原体，支原体的感染会严重影响动物健康和实验数据[2]。支原体污染是细胞培养中经常遇到的难题，本设施要求实验人员对其细胞培养液进行自检，支原体阴性的细胞方可带入屏障设施。一旦发现有支原体阳性材料做过的动物实验，相关小鼠须移出屏障设施。考虑到动物实验的连续性，本单位在实践中设有一个小型设施，用于接纳可能被污染的实验动物，避免造成支原体在控制严格的大型设施内传播。这样可以降低出现阳性结果后对实验的影响，让大部分实验人员能够做到切实配合送检，既能保护大型屏障设施内的动物，也不会引起动物实验人员的抵触。另外，当细胞出现支原体污染，实验人员往往会使用一些抗支原体的药物加在培养液中进行控制，经过一段时间的药物使用，细胞中的支原体会大幅减少，但是这样的细胞系往往在停药一段时间后又能被检测到支原体。

为了探究收检的实验材料所携带的细菌类别，本单位通过测序鉴定到12 种细菌。其中链球菌是SPF 级实验小鼠需排除的微生物，其余11种细菌未列入检测排除项。这11 种细菌中，也有一些可影响人类或实验动物健康，应加以关注。比如检出次数最多的缓慢葡萄球菌曾被认为不具有致病性，但越来越多的资料表明它是人类或许多动物不可忽视的致病菌，对于免疫力低下的人群或动物可导致严重的后果，并能引起实验小鼠的慢性死亡[3]；木糖葡萄球菌广泛分散于自然界，以往认为是非致病菌，但此菌引起的感染时有报道[4]；产酸克雷伯菌虽未像肺炎克雷伯菌那样须在SPF 级实验小鼠中排除，但该菌同样是重要的条件致病菌，主要寄生在人和动物的呼吸道和肠道，而实验小鼠也对该菌易感[5]。由此可见实验材料中携带微生物的种类非常多样，因此一定要预先无菌处理，将其对实验小鼠的危害降到最低。后续本单位将继续检控实验材料，当出现阳性结果时，进一步探究不同实验材料中容易携带的微生物种类，以便进一步探讨其对实验动物健康可能产生的影响。

总之，用于动物实验的实验材料都将与实验动物直接接触，其携带微生物的污染势必影响实验动物的健康，进而影响动物实验数据的可靠性，还可能造成动物发病，并在屏障设施内传播，所以对动物实验材料进行检控也就显得必要和重要。本单位持续多年对实验材料检控的做法，有效保障了SPF 级实验小鼠质量和设施安全，这一经验对类似动物实验屏障设施的运行管理具有参考意义。