改良R18S3冷冻液对cre转基因小鼠精子冷冻效果探讨

陈 瑜, 王芊芊, 张 匀

(浙江大学1. 实验动物中心, 2. 附属第二医院, 杭州 310058)

改良R18S3冷冻液对cre转基因小鼠精子冷冻效果探讨

陈 瑜1, 王芊芊1, 张 匀2

(浙江大学1. 实验动物中心, 2. 附属第二医院, 杭州 310058)

目的 比较改良精子冷冻液与传统冷冻液对cre转基因小鼠的精子冻存和体外受精率的影响，建立采用精子冷冻技术稳定保存两种cre转基因小鼠的方法。方法 以R18S3作为精子冷冻液和以R18S3作为基础液添加477μmol/L的硫代甘油(MTG)配成R18S3+MTG冷冻液，冻存Neurog3-cre和Itgax-cre雄鼠精子,采用相同方法复苏精子。同时,以两种cre小鼠的背景鼠C57BL/6J作为对照组，另选用ICR和FVB小鼠用两种冷冻液冻存并复苏精子，进行体外受精，统计受精率来评价精子冷冻效果。结果 以R18S3冷冻并复苏的两种cre小鼠及野生型C57BL/6J的精子体外受精率分别为10.5%，11.6%和12.0%，无显著差异。以R18S3+MTG冷冻并复苏的精子体外受精率分别为66.4%，62.5%和67.6%，相对传统冷冻液有显著提高。ICR和FVB小鼠用改良精子冷冻液前后的体外受精率分别是34.1%，46.7%和65.7%和70.2%，后者都有所提高。结论 改良后的R18S3+MTG冷冻液能明显提高以C57BL/6J为背景的cre转基因小鼠冷冻后精子的体外受精率，对ICR和FVB品系的小鼠的体外受精率也有提高。

精子冷冻; 传统冷冻液; 改良冷冻液; 体外受精率; cre转基因小鼠

在条件性基因敲除小鼠研究中，cre转基因小鼠以其能在时空上调控特定基因的关闭而显示出极大的优势，因而又被称为cre工具鼠[1～3]。然而获得并维持一个转基因小鼠品系实为不易且成本高昂。故此，胚胎和精子冻存，体外受精等保种技术是保存cre转基因小鼠的有效方法。

本文通过两种精子冷冻液对B6.FVB(Cg)-Tg (Neurog3-cre)C1Able/J(简称Neurog3-cre小鼠)和C57BL/6J-Tg (Itgax-cre, -EGFP)4097Ach/J(简称Itgax-cre小鼠)两种转基因小鼠品系以及ICR和FVB品系小鼠的冷冻精子体外受精率的比较, 来探索用精子快速冷冻法保存这两种cre转基因小鼠的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验组: 用于采精的cre转基因阳性雄鼠购于美国The Jackson Lab，后在浙江大学实验动物中心[SYXK(浙)2007-0098]繁殖扩群获得的8～12周龄的雄鼠，实验2周前与雌鼠交配后单笼饲养。供卵雌鼠选用SPF级4周龄的C57BL/6J小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2007-0005]。对照组: SPF级C57BL/6J、ICR和FVB雌雄鼠分别为4周龄和8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 动物饲养与实验条件

动物饲养于SPF级屏障环境中，室内温度为21℃～25℃，相对湿度为40%～60%。饲料辐照消毒, 小鼠自由采食和饮水。明暗周期为12 h∶12 h (8∶00a.m～8∶00p.m, 为光照时间)。

1.3 试剂与仪器

试剂: 注射用孕马血清素(PMSG)(生产批号: 111118)和注射用人绒毛膜促性腺激素(hCG)(生产批号: 110426), 杭州动物药品厂, 规格为: 1 000 IU/支,冻干粉剂, 分别于4℃、-20℃保存, 使用前用0.9%生理盐水配制成稀释液, 矿物油(Sigma, M 8410-1L), Raffinose(棉籽糖)(Sigma, R7630)，脱脂奶(Difco), HTF培养液由本实验自行配制(参考: 小鼠胚胎操作实验指南)，配制后用0.22 μm的滤器过滤。仪器:超净工作台, CO2恒温培养箱(Thermo)， Olympus显微镜，纯水仪，高压灭菌锅，培养皿(NUNC)，酒精灯，自制洗卵针，显微镊，移液枪，精子冻存麦管，液氮罐等。

1.4 方法

1.4.1 两种精子冷冻液的配制 R18S3的配制: Raffinose, 脱脂奶按18%(W/V)和3%(W/V)的比例与双蒸水在60℃温水中充分溶解后, 12 000 r/min离心10 min, 取上清液用0.22 μm的过滤器过滤后备用。R18S3+MTG的配制: 在4.75 m l的M 2中加入40 μl的MTG, 用0.22 μm的过滤器过滤后配成100 mmol/L的M TG存放于4℃冰箱中。精子冻存实验当日，将R18S3和100 mmol/L的MTG按200∶1的比例混合配成R18S3+MTG冷冻液。

1.4.2 精子采集及冻存 实验组: 颈椎脱臼法处死2月龄以上与雌鼠交配后单笼饲养一周的雄鼠，腹部用75%酒精消毒，打开腹腔，取出附睾尾，除去脂肪并用滤纸擦去血渍，分别将左右附睾尾放入R18S3和R18S3+MTG中，以显微镊刺破附睾尾，使精子流出，指根轻弹10次，使之与冷冻液充分混合, 将麦管装在1 m l注射器上，依次吸入100 μl HTF、10 mm空气柱、10μl精子悬液，将麦管近精子悬液端封口，在液氮表面静置3～5 min后，存入液氮中保存。

1.4.3 雌鼠超排和取卵 两组实验均采用4周龄的雌鼠, 于第一日下午5∶00腹腔注射10 IU的PMSG, 48 h后再腹腔注射10 IU的HCG, 注射后16 h取卵。颈椎脱臼法处死雌鼠, 消毒体表, 剪下双侧输卵管放入平衡2 h的HTF液滴旁的矿物油中, 在显微镜下刺破输卵管膨大部，用显微镊子将卵子团引入HTF液滴中, 每100 μl HTF液滴中放入30～40枚卵。1.4.4 精子复苏和体外授精 在取卵的当日将冻存的精子于液氮罐中取出, 迅速置于37℃水浴中15 min。取出麦管擦干表面水滴，剪断麦管精子端的封口，将精子悬液推入预先在CO2恒温培养箱中平衡2 h的100 μl HTF中，获能1.5 h。根据精子活力和浓度用微量移液器吸取适量精子(约10μl, 每μl约80～100个精子)悬液加入卵细胞附近。再将培养皿放入37℃、5%的CO2恒温培养箱中培养24 h。次日早晨统计2-细胞胚胎数、未受精卵和异形卵数,计算体外受精率。

1.5 实验数据统计分析

采用单因素方差分析对两组精子冷冻液之间的数据进行方差分析。

2 结果

2.1 以C57BL/6J为背景的三组小鼠体外受精率的比较

用传统的R18S3作冷冻液，Neurog3-cre、Itgax -cre 和C57BL/6J小鼠精子复苏后的受精率(2-细胞胚胎数/卵子总数)，两种cre小鼠和其背景鼠的复苏精子受精率都比较低，三者之间无显著差异(P＞0.05)(表1)。用作者改良的R18S3+MTG作冷冻保护剂，两种cre小鼠与其对照组C57BL/6J小鼠之间也无显著统计学差异(P＞0.05)(表1)。单个品系的小鼠分别用R18S3和R18S3+MTG作为精子冷冻液的受精率都有较大差异。相比用R18S3冷冻液,三种小鼠平均受精率为11.4%, 用R18S3+MTG作为精子冷冻液的平均受精率为65.5%，有明显提高(P＜0.05)。

2.2 C57BL/6J、ICR和FVB三种小鼠用改良精子冷冻液前后的体外受精率比较

C57BL/6J、ICR和FVB三种小鼠用传统冷冻液冷冻精子复苏后的受精率均低于50%, 改良的冷冻液冷冻复苏后的体外受精率均相比传统冷冻液有明显提高(P＜0.05), 其中以C57BL/6J差异最大(表1)。

3 讨论

自Nakagata等报道用棉籽糖-脱脂奶粉(R18S3)作为小鼠精子冷冻保护剂以来[4]，逐步建立了相对稳定的小鼠精子冷冻保存方法，并一直沿用至今。世界上许多实验室重复了以R18S3作为精子冷冻保护剂的方法，证明对于远交系和杂合背景的小鼠，这种保护剂可获得比较理想的体外受精率[5,6]。但对于近交品系如C57BL/6J，BALB/c和129S3等小鼠, R18S3冷冻后的精子体外受精率普遍较低[7～12]。本实验中两种cre小鼠和其背景小鼠的实验结果也证实了单纯采用R18S3很难达到通过精子冻存保存转基因小鼠品系的目的。而大量的基因修饰小鼠的背景都是近交系，所以一定要改良R18S3来建立保存近交系小鼠的方法。

表1 两种精子冷冻液冷冻五种小鼠精子后体外受精率比较

Ecroyd等[13]提到精子内源性产生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在精子获能反应中起很大作用，但精子冻存复苏后，产生过量的ROS是引起精子细胞损伤和降低精子受精能力的因素[14], Ostermeier等[15]选择添加MTG作为改良传统R18S3, 原因可能是MTG作为一种还原剂被广泛应用于无血清的ES细胞培养基[16], 在复苏精子进行体外受精的体系中MTG能降低ROS的浓度，从而减少精子损伤。实验显示添加了477 μmol的MTG后,冻存精子的体外受精率有了大幅提高。本实验结果也证实了，改良后的精子冷冻液可以达到比较稳定的复苏后的体外受精率，且这两种cre小鼠与其背景小鼠的体外受精率没有明显差异。

作为条件性基因敲除小鼠的工具鼠，cre小鼠在基因工程小鼠研究中的地位举足轻重。但最终获得条件型基因敲除小鼠后，特定的cre小鼠又暂时不会被使用。活体保存必然会消耗大量的资源，相比之下，精子冻存有节约资源、避免疫病传播，防止长期饲养引起基因漂移等优势[11,17]。改良后的R18S3+MTG精子冷冻液配制简便，易操作，能实现这两种cre小鼠的品系保存，在cre小鼠的品系保存方面有较大应用前景。

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Q95-33

B

1674-5817(2014)01-0053-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.011

2013-10-10

陈 瑜(1990-), 主要从事转基因小鼠的研制和实验

小鼠净化及其生殖细胞冷冻保存工作, E-mail: Charleschen 2005@gmail.com