丙型肝炎病毒截短型核心C区和NS3区融合蛋白(C8-NS3)的原核表达

聂东宋,刘 宇, 冯惊涛,胡道奇

(1.湖南理工学院 化学化工学院,湖南 岳阳 414006;2.湖南景达制药有限公司,湖南 岳阳 414001)

丙型肝炎病毒截短型核心C区和NS3区融合蛋白(C8-NS3)的原核表达

聂东宋1,刘 宇1, 冯惊涛2,胡道奇2

(1.湖南理工学院 化学化工学院,湖南 岳阳 414006;2.湖南景达制药有限公司,湖南 岳阳 414001)

通过RT-PCR从HCV 全长基因组中分别克隆HCV核心区和NS3非结构区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达载体pTrcHis2 TOPO TA中,转化大肠杆菌Top10,阳性克隆经IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经15% SDS- PAGE鉴定,重组蛋白经His标签纯化.经IPTG诱导可高效表达分子量约为14.4KD的融合抗原,重组蛋白主要以可溶性形式存在.经过纯化目的蛋白纯度达96.3% 以上的,表达量约为550µg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.

丙型肝炎病毒;蛋白表达;抗原检测

丙型肝炎病毒( hepatitis C virus,HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一种危害严重的传染病,HCV 主要通过输血传播,可以导致多种临床型的肝炎及其他肝脏疾病,包括肝硬化及肝癌.全世界 HCV 感染人数达 1.7 亿,我国HCV感染者已超过 4000 万,因此,丙型肝炎已经成为全球性严重的社会公共卫生问题之一.

HCV 基因组为单股正链RNA,约9.5 kb,仅含一个开放阅读框,翻译成一个约3 010～3 033 个氨基酸的聚蛋白前体,由宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶加工成多个成熟蛋白[1].人感染HCV后,抗HCV核心蛋白和抗NS3蛋白的抗体出现较早,持续时间较长,是HCV早期诊断的可靠依据,对于缩短“窗口期”[2]、尽早检测出HCV 感染以及监测患者体内病毒载量、评价治疗效果有着极其重要的意义.其中HCV核心蛋白是HCV 结构基因core编码的一种结构蛋白,全长191个氨基酸,其氨基酸序列十分保守.核心蛋白(C蛋白)抗体在人感染HCV后出现较早,抗原免疫原性最强且持续时间长,但由于核心蛋白为强碱性蛋白,且具细胞毒性,全长core基因在原核表达系统中很难稳定表达.HCV非结构蛋白NS3分子量为70kDa,有丝氨酸蛋白酶和ATP 酶及RNA 解旋酶活性,参与聚蛋白前体加工和RNA 复制过程[3～5].NS3蛋白也较早被用于HCV 的血清学检测,与其它HCV 结构蛋白相比,NS3灵敏度最高,同时丙肝抗体动态研究表明,NS3抗体也在HCV 感染早期出现[6,7].由此可知,核心蛋白抗原和NS3抗原在丙型肝炎的检测中起很重要作用,提高检测C蛋白和NS3抗体灵敏度在HCV 的早期检测中有重要意义.

本研究首先通过重叠延伸PCR 技术(overlap extension PCR,OE PCR),把HCV核心区(HCV-core:8-36aa)和NS3非结构区(NS3:1393-1457aa)的部分优势表面抗原基因串联,克隆HCV复合多表位融合基因,构建入原核表达载体pTrcHis2 TOPO TA中,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化,初步分析其抗原性和免疫原性,为HCV临床检测提供理想的诊断抗原奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

HCV抗原阳性血清由湖南景达制药有限公司中心实验室提供;pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits 购自美国invitrogen公司;Advantage 2 PCR Kit购自美国CLONETECH公司;pUC Mix Marker,8购自立陶宛Fermentas公司;羊抗人IgG购自Sigma公司;菌株BL21为湖南景达制药有限公司中心实验室保存菌种.HCV 抗体检测试剂盒购自上海科华生物技术公司,HCV 抗原检测试剂盒由湖南景达制药有限公司提供,其余化学试剂为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 OE-PCR法拼接和扩增HCV嵌合基因片段

采用BioSun3.0生物软件分析HCV(GenBank accession NO:AB492206.1)氨基酸序列的抗原表位,选取HCV核心区和NS3非结构区带有优势抗原表位区域的两段HCV多肽,找出对应碱基序列,设计引物 4条,分别为:

引物由上海生工合成.然后用逆转录PCR的方法从HCV阳性血清中扩增出HCV-core、HCV-NS3两段目的基因.将PCR产物用DNA产物纯化试剂盒纯化,然后取等量的各种DNA加入Advantage 2 PCR Kit的PCR反应体系中,在不加任何其他引物的情况下反应5～7个循环(98℃ 10s,68℃,1.2 min);然后向该PCR体系中加入引物HCV-core-F和HCV-NS3-R,继续反应30个循环,取产物5μL进行1.7%琼脂糖凝胶电泳.

1.2.2 原核表达载体的构建与鉴定

将拼接扩增好的HCV嵌合基因按照pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits说明书克隆入pTrcHis2 TOPO TA表达载体,转化大肠杆菌Top10,进行PCR筛选(上游引物由试剂盒提供,下游引物为HCV-NS3-R).阳性克隆经测序分析正确后,进行融合蛋白的诱导表达.

1.2.3 HCV嵌合抗原的诱导表达和抗原表达方式的确定

将筛选到的阳性克隆菌株接种于LB培养基中(含氨苄青霉素50 μg/mL),37℃振荡培养过夜.然后按照1:50的比例接种到1000 mL LB培养基中(含氨苄青霉素50 μg/mL),37℃振荡培养3～4h,直至A600值约为0.6时,加入IPTG诱导目的蛋白表达4～6 h后,收集1 mL菌液,12000 r/min离心2 min.沉淀重悬于400 μL的1×SDS上样缓冲液中,沸水浴5 min,取20μL进行15% SDS-PAGE胶电泳.

取经过诱导表达的细菌1.5 mL,12000转离心2 min,收集菌体重悬于300μL双蒸水中,超声破碎菌体细胞,12000转离心10 min.上清用等体积的2×SDS上样缓冲液处理,沉淀用300 μL 1×SDS上样缓冲液重悬,沸水浴5 min,取20 μL进行15% SDS-PAGE胶电泳.

1.2.4 HCV嵌合抗原的诱导表达时间选择和纯化

HCV嵌合抗原的纯化:将1000 mL 的表达菌,10000 r/min离心10 min收集菌体.将菌体悬浮于60 mL缓冲液bufferⅠ(20 mM Tris,500 mM NaCl,pH 7.9),冰浴情况下超声破碎直至菌体清亮(约30 min),4℃,12000 r/min离心15 min,取上清,然后进行His标签纯化,最后用15% SDS-PAGE胶鉴定.

1.2.5 融合蛋白的抗原性的初步鉴定

把纯化的HCV 融合抗原作适当稀释包被酶标板,用牛血清白蛋白封闭,分别加入10 μL 人丙肝阳性血清或阴性血清和90 μL PBS,37℃接触反应30 min,洗涤后再加入稀释的过氧化物酶标记的羊抗人IgG反应(40℃,20 min),用TMB显色,测A450值.

2 结果

2.1 HCV嵌合基因的拼接和扩增

重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变,且可以在侧引物的两端设计酶切位点,方便进一步的连接克隆,目前该方法已经广泛用于基因突变体的构建.我们采用该方法成功构建HCV核心抗原和NS3嵌合体(C8-NS3)的构建,如图1所示,重叠延伸PCR拼接和扩增的嵌合基因大小为 282 bp,符合HCV嵌合基因的预期结果.

图1 OE-PCR拼接的嵌合基因C8-NS3

2.2 HCV嵌合抗原的诱导表达

原核表达载体pTrcHis2 TOPOTA是一种带有T末端表达载体,可以将带有A尾的PCR产物直接插入到载体中去,然后通过 PCR筛选,方便快捷地构建原核表达载体.pTrcHis2 TOPO TA在表达产物的末端带有六个His氨基酸,使后续的蛋白纯化大大简化,方便得到纯度很高的重组蛋白产物.我们构建的原核表达载体表达的 HCV嵌合抗原理论分子量大约为 14.4KD.据图2所示,诱导表达后较诱导表达前在约14.4KD处有一明显的蛋白成分,与预期分子量一致.表达产物主要以可溶性的形式存在(图2,图3).

图2 大肠杆菌中嵌合基因表达产物的15% SDS-PAGE鉴定

图3 大肠杆菌中嵌合基因表达位置的确定(15% SDS-PAGE)

2.3 HCV嵌合抗原的纯化

1000 mL 表达菌,经超声波破菌后,收集菌体上清.将上清进行His标签纯化,最后用15% SDS-PAGE胶鉴定(图4),结果表明在 14.4KD处为单一条带,没有其它条带出现,扫描结果表明纯化后目的蛋白的纯度约为96.3%.BCA试剂盒分析表明:蛋白表达量约为550 µg/mL.

图4 纯化HCV核心区融合蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 抗原活性分析

用纯化的目的蛋白包板,间接ELISA检测HCV内质控阳性血清, 结果(见表1)表明,在10份已知慢性HCV 患者血清中检出阳性10份,A值均数为2.003,阳性率100%;而作为对照的5份HBsAg阳性血清、5份正常人HCV阴性血清与嵌合蛋白进行的ELISA结果均呈阴性反应,A值均数为0.068.说明表达的嵌合抗原具有良好的免疫原性和特异性.

表1 纯化嵌合蛋白的ELISA检测结果

3 讨论

目前市售的 HCV ELISA检测试剂盒所用抗原主要是基因表达和多肽合成,有单独使用,也有混合使用,主要包括了核心区和NS3非结构区等抗原.但由于抗原的选择区域并不完全同于天然的抗原,有时会因比出现漏检现象,而影响检测的灵敏度和特异性.HCV感染者血清中绝大部分都有核心区蛋白和NS3非结构区蛋白的抗体出现且持续存在,因此表达HCV核心区和NS3非结构区的融合蛋白,可以有效避免HCV感染者的漏检.以前报道嵌合基因的连接多是采用人工合成的短接头,或在拼接基因相连引物中设计一个相同的酶切位点进行连接,该方法操作复杂,且要求连接的各种成分能够形成各自正常的空间结构,以保持天然活性.因而连接肽的长度、所选氨基酸的组分及其伸展性或活性基团能否充分暴露等都是关键.我们采用重叠延伸PCR技术(OE-PCR)拼接嵌合基因,在连接肽中不必因限制性酶切位点,而引入不必要的氨基酸残基,快速构建了含有核心和NS3片段的嵌合基因.由于此技术是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组,因此不需要内切酶消化和连接酶处理,是一种高效快速获得融合基因的好方法.通过BioSun3.0生物软件分析HCV氨基酸序列的优势抗原表位,选取HCV-core(8-36aa)和HCV-NS3(1393-1457aa)两段多肽进行嵌合,与我们以前构建的嵌合蛋白形成有效地补充.构建了含有C 区和NS3区的表面优势抗原基因的融合表达质粒pTrcHis-C8-NS3.在不降低其免疫活性的基础上,尽量减少其蛋白分子量,可使得其在大肠杆菌中易于表达,并增加蛋白稳定性.

本研究采用的表达系统为pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits,此系统为T载体表达系统,可以方便地构建表达载体.同时,该载体所表达的融合蛋白带有6个组氨酸尾巴,使得该融合蛋白的纯化方便、易行,并能有效地得到纯度很高的表达蛋白.

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[6]孙家华,盛 蕾,袁桂玉.丙型肝炎实验室诊断研究进展[J].国外医学病毒学分册,1998,5 (4):113～11

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Expression of Truncated HCV Core and NS3Antigen and Its Immunogenicity Assay

NIE Dong-song1,LIU Yu1,FENG Jing-tao2,HU Dao-qi2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Science and Technology,Yueyang 414006,China;2.Hunan Jingda Bioengineering Co.LTD,Yueyang 414001,China)

DNA fragments of HCV Core fragment and NS3fragment were obtained from HCV genome by RT-PCR,then all the fragments were linked by overlap extension PCR (OE-PCR)to form a chimeric gene C8-NS3.The chimeric gene was then ligated to expression vector pTrcHis2 TOPO TA and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and.Ni+affinity column was used to purify the recombinant proteins.The recombinant protein was correctly expressed;a band of 14.4 kD was detected by 15% SDS-PAGE and Western blot analysis.After purification to over 96.3%,its yield amounted to 550µg/mL.ELISA result shows that the purified protein has good antigenicity.

hepatitis C virus (HCV);protein expression;antigen analysis

Q786

A

1672-5298(2010)04-0042-04

2010-09-09

国家高技术发展研究计划(863)重点课题(2006AA020907);中国博士后科学基金资助项目(20070410996)

聂东宋(1967− ),男,湖南衡阳人,湖南理工学院化学化工学院副教授.主要研究方向:新基因克隆及功能研究