实时荧光PCR技术检测致敏原小麦的研究

董 薇,曹际娟,郑秋月,吴元华

(1.沈阳农业大学 植物保护学院,沈阳110161;2.辽宁出入境检验检疫局,辽宁 大连 116001)

实时荧光PCR技术检测致敏原小麦的研究

董 薇1,2,曹际娟2,郑秋月2,吴元华1

(1.沈阳农业大学 植物保护学院,沈阳110161;2.辽宁出入境检验检疫局,辽宁 大连 116001)

采用实时荧光PCR技术检测致敏原小麦成分.试验结果表明:采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的特异性检测引物和探针进行检测时,26种样品经实时PCR扩增,只有小麦产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对小麦致敏原基因的检测灵敏度较高,可达到1 mg·kg-1,符合痕量检测要求.

小麦;实时PCR;致敏原检测

近年来,食物过敏的发生率正持续增加,过敏性疾病发病在全球呈逐年上升趋势,发达国家超过20%的人受过敏性疾病的困扰[1].致敏原又称过敏原或变态反应原,是指能够使人发生过敏的抗原.美国和欧盟从2007年开始执行新的食品过敏原标签法规,法规分别要求生产企业明确标明其产品中是否含有8大类和12种主要的食品过敏原,包括小麦、大豆、花生、芹菜、芥末、芝麻和坚果,畜禽产品,水产品等.根据小麦致敏原以及潜在的致敏免疫机制表明:小麦过敏会影响皮肤、内脏、呼吸道的健康,引起运动激发过敏症、职业哮喘、鼻炎、接触性荨麻疹等.传统的生物活性检测精确度和灵敏度不高,目前采用实时荧光PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,具有实时监测、消除交叉污染、特异性强、定量结果准确等特点.本试验采用实时荧光PCR技术,建立了食品中致敏原小麦成分的快速检测方法,为食品致敏原的标签管理、监管、检测提供了可靠的技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2008年8月在辽宁出入境检验检疫局技术中心实验室进行.试验所用小麦、大麦、燕麦、荞麦、黑麦、白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米等26份样品由大连农业科学院、沈阳农业大学等多家单位提供,或购于大连家乐福超市.Taqman GEx Master PCR酶预混液购于美国ABI公司.用于DNA提取的主要试剂CTAB缓冲液配制方法如下:55 mmol/L CTAB,1400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用10 % 盐酸调pH至8.0,121℃,高压灭菌20 min,备用.ABI 7300实时荧光PCR仪,核酸蛋白分析仪,台式高速冷冻离心机.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的抽提

采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA提取试剂盒(货号:DV811A)并按其操作说明进行抽提样品DNA.

1.2.2 DNA浓度和纯度的测定

取5 μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1 mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的光密度值.DNA的浓度按照公式

计算获得.其中C为DNA浓度(μg/μL);A为260 nm处的吸光值;N为核酸稀释倍数;1OD260nm＝50 μg/mL双链DNA.当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时,适宜于PCR扩增.

1.2.3 引物和探针设计

根据NCBI上已公布的小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的核酸序列,在引物的设计上对小麦管家基因检测引物和探针的退火温度的一致性,GC含量的相似性等因素进行了充分的考虑,采用DNAMAN 8.0软件设计了小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的引物和探针.序列如下:

检测GAG56D基因的引物和探针序列:

正向引物:5′-CAA CAA TTT TCT CAG CCC CAA CA-3′

反向引物:5′-TTC TTG CAT GGG TTC ACC TGT T-3′

探针:5′-FAM-TTC CCG CAG CCC CAA CAA CCG C-Eclipse-3′

检测Wx012基因的引物和探针序列:

正向引物:5′-GTC GCG GGA ACA GAG GTG T-3′

反向引物:5′-GGT GTT CCT CCA TTG CGA AA-3′

探针:5′-FAM-CAA GGC GGC CGA AAT AAG TTG CC-Eclipse-3′

1.2.4 实时PCR反应体系和反应程序

实时PCR反应体系(体积为 25 µL):10×PCR缓冲液(含Mg2+)5 μL、正反向引物各(10 μmol/L)1 μL、探针(10 μmol/L)1 μL、dNTPs(10 μmol/L)2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U)0.2 μL、模板DNA(0.1～2 μg)2 μL,水补足至 25 μL.

实时PCR反应程序为:95 ℃ /10 min ,1个循环;95℃/15 s,60℃ /1 min,40个循环,在每次循环的退火时收集荧光.检测结束后,根据扩增曲线和Ct值判定结果.

1.2.5 结果判断

同时进行的阴性、阳性、空白对照试验结果正常,检测样品有明显的荧光增幅曲线,且Ct值≤35,则判断样品中检出致敏原小麦成分.若检测样品荧光增幅曲线的Ct值在35～40之间,则应重新进行实时荧光PCR反应.如果再次扩增后的结果Ct值仍在35～40之间,可判断样品中检出致敏原小麦成分,否则可判断样品中未检出致敏原小麦成分.

1.2.6 特异性试验

选取与样品同科同属的物种,用于待测样品的特异性试验.

1.2.7 灵敏度试验

将小麦样品研磨粉碎处理后,按照不同的重量比分别添加到不含小麦致敏原基因的植物为原料的米粉基质中,制备成20,10,5,2 ,1,0.5,0.2,0.1,0 mg·kg-1共9个梯度含量的添加样品.应用本方法分别进行检测,以确定本方法的检测灵敏度.

2 结果与分析

2.1 特异性分析结果

采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因引物和探针进行检测,26种样品经Taqman 探针实时PCR扩增,只有小麦产生荧光信号,其余样品均未产生荧光信号(图1).可见,本研究所采用的小麦管家基因GAG56D和Wx012基因检测引物和探针具有很好的特异性.

图1 小麦特异性检测结果

2.2 灵敏度试验结果

检测结果表明(图2),含量分别 为 20mg·kg-1、 10mg·kg-1、5mg·kg-1、2mg·kg-1、1mg·kg-1的小麦过敏原添加样品均能很好检出荧光信号,而低于 0.5mg·kg-1以下含量的添加样品则检测不出荧光信号.表明该方法对小麦致敏原基因的检测灵敏度较高,可达到 1 mg·kg-1.

图2 小麦致敏原灵敏度试验结果

2.3 实际应用检测

运用本方法共检测了 280份实际样品.其中检测小麦原料样品73份,阳性符合率为100%.检测小麦加工制品 95份,阳性符合率也为 100%.检测婴儿食品和小食品112份,其中检出含有小麦致敏原基因的样品为21份,其余91份样品未检出小麦致敏原基因,这些结果与食品标签的标识相符合.由大量的实际应用结果可见,应用本方法检测小麦致敏原基因成分,具有较好的应用效果.

3 讨论

目前针对食品致敏原的检测方法,主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰剂对照激发试验,体外检测的血清IgE试验和组胺释放试验, PCR检测,以及实时荧光PCR检测方法等[1].传统的体内检测试验直接检测是否存在过敏蛋白质,由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖,造成试验结果假阴性.DNA比蛋白质更耐受热处理和压力作用,尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体.PCR方法中,在热变性条件下目标DNA可以有效提取而不象蛋白提取时受食物基质的影响较大;另一个优点是它的稳定性,它不象蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响.

实时荧光PCR技术与常规PCR相比,它具有特异准确、可有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点.可以通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程.因此我们可以通过实时荧光PCR方法更快、更准确地检测出食品致敏原成分基因,从而判断食品中是否存在过敏原[2].

本研究采用实时荧光PCR技术,建立了食品中致敏原小麦成分快速检测方法,该方法的灵敏度高,检测低限可达到1 mg·kg-1;方法特异性强,与对照组24种样品无交叉反应.在实际应用检测中,共检测280份样品,阳性符合率为 100%,具有较好的应用效果.该方法操作步骤简单,检测时限短,结果判断准确,适用于小麦致敏原的快速诊断和大量样品的检测.

[1]黄 峙,郭宝江.食品过敏原检测与评价技术研究进展[J].食品科学,2003,24(8):240～244

[2]HIRD H,LLOYD J,GOODIER R,et al.Detection of peanut using real-time polymerase chain reaction[J].Eur Food Res Technol,2003,217:265～268

Detecting Allergen Wheat in Food by Real-Time PCR

DONG Wei1,2,CAO Ji-juan2,ZHENG Qiu-yue2,WU Yuan-hua1
(1.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China;2.Liaoning Entry-Exit Inspection &Quarantine Bureau,Dalian 116001,China)

To identify wheat in food,a real-time fluorescent PCR assay is performed in this study.The experiment result shows that the primers and probe of GAG56D和Wx012 gene of wheat could specifically identify wheat with 26 kinds of sample.Sensitivities results show that 1 mg·kg-1for wheat of food could be detected,and meet the need of trace amount detection.

wheat;real-time PCR;allergen detection

Q946

A

1672-5298(2010)04-0054-04

2010-09-05

国家公益性行业科研专项课题(2007GYJ036)

董 薇(1978− ),女,沈阳农业大学植物保护学院博士研究生.主要研究方向:有害生物与环境安全研究