介孔二氧化硅纳米颗粒经氧化应激所致肾细胞毒性及GSK-3β在其中的作用

吕银银 李 珂 易 维 刘素鹏 周 婕,2*

1(宜春学院医学院基础医学部，江西 宜春 336000) 2(宜春学院医学院转化医学中心，江西 宜春 336000)

引言

介孔二氧化硅纳米材料(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)是一种通过无机前体与有机表面活性剂相互作用而组装形成的体系，其孔径处于纳米量级(2～50 nm)。近年来，MSNs作为载药、成像等工具，在生物医学领域中得到了广泛研究与应用[1-4]。与此同时，由MSNs引起的生物体毒性反应也逐渐受到关注，其体内外潜在的毒性已成为限制其使用的主要原因。研究报道，MSNs能造成多种组织、脏器损伤，如引起肝脏[5]、脾脏出现炎症反应，诱导Kupffer细胞聚集；使肾脏肾小管萎缩、坏死，肾间质纤维组织增生[6-7]；促进红细胞溶血，诱发胃肠道出血等[8]。体外研究也发现，MSNs能明显诱导A431和A549细胞出现氧化应激，使细胞内蛋白错误折叠增多[9]；引起PBMC细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)堆积，诱导炎性因子IL-6、IL-1β等释放[10]；诱导Caco-2细胞产生大量活性氧，降低细胞内ATP含量，激活caspase-3/7，造成细胞膜损伤，导致细胞凋亡[8]。

在糖尿病肾病[11]、IgA肾病[12]、肾缺血再灌注损伤[13]等疾病模型中，已证实氧化应激损伤是这些疾病的主要诱因之一。线粒体作为细胞内ROS的主要来源，同时也是ROS的攻击靶标，在受到损伤后能介导凋亡的发生。在ROS大量堆积的胰岛B细胞中，氯化锂通过抑制GSK-3β活性、下调NOX4表达、上调SOD水平来减少ROS生成，减轻线粒体脂质过氧化，对抗细胞凋亡[14]。因此，笔者采用NRK-52E细胞，研究MSNs诱导的肾细胞毒性以及GSK-3β信号通路在其中的作用；并使用经典抗氧化剂NAC，从线粒体功能和抗氧化水平来探究GSK-3β、氧化应激与MSNs肾毒性间的关系，为MSNs的毒性与减毒研究提供试验条件。

1 材料

NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞，通过扬州博新生物科技有限公司代理，购于ATCC细胞库。粒径为200 nm的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)，由宜春学院医学院转化医学中心提供。给药用的MSNs溶液在无菌环境下配制，将称取所得的无菌MSNs加入细胞培养基中，封口膜封闭管口后，在涡旋和超声处理下，使之均匀分散于溶剂中，每次给药的MSNs分散液都采取临用临配。

试剂：MTT、N-乙酰半胱氨酸(NAC)均购于Sigma 公司。SOD、GSH、CAT检测试剂盒，线粒体膜电位检测试剂盒，BCA蛋白含量检测试剂盒，ProteoJETTM细胞裂解液，线粒体蛋白提取试剂盒，均购于碧云天生物技术研究所。胰蛋白酶(1∶250)、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素及链霉素，均购于Gibco公司。GSK-3β/P-GSK-3β抗体、Cleaved-Caspase-3抗体、Cyt C抗体、COX4抗体、GAPDH抗体、羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗，均购自美国 Santa Cruz公司。

仪器：Nikon DM5000B正置显微镜，Nikon Ti-S倒置荧光显微镜，Thermo多功能酶标仪，ChemiDoc凝胶成像系统、DFC500型数码摄像机，Qwin V3图像采集系统，Milli-Q 超纯水系统。

2 方法

2.1 透射电镜观察MSNs的形态

取适量MSNs样品，超声使其均匀分散在5%葡萄糖中，随后将样品溶液置于样品台上，使用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察其外观形貌、分散性和均匀性，并使用Nano Measurer 1.2软件对其粒径分布进行统计分析。

2.2 MTT法检测细胞活性

取对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶处理后收集、重悬，按每孔5×103个细胞，将其接种于96孔板中，置于37℃、含5% CO2的培养箱中培养24 h，再更换含不同浓度(0, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL)MSNs的培养基继续作用24 h，或者更换含400 μg/mL MSNs的培养基培养0、3、6、9、12、24 h。在NAC预处理的实验中，使用1 μmol/L NAC预处理细胞2 h，然后分成Con组、MSNs(400 μg/mL)+NAC(1 μmol/L)组、MSNs(400 μg/mL)组和NAC(1 μmol/L)组继续孵育24 h。细胞经对应处理后，将96孔板从细胞培养箱中取出，吸去上清液，加入MTT溶液进行避光孵育。4 h后将96孔板从细胞培养箱中取出，吸尽上清液并加入100 μL DMSO，振荡使生成的紫色结晶物充分溶解，在495 nm波长处检测吸光度。按上述方法，实验重复3 次。

2.3 细胞内SOD、GSH、CAT检测

将细胞置于37℃、含5% CO2培养箱中培养24 h，再更换含400 μg/mL MSNs的培养基培养0、3、6、9、12、24 h。在NAC预处理的实验中，使用1 μmol/L NAC预处理细胞2 h，然后分成Con组、MSNs(400 μg/mL)+NAC(1 μmol/L)组、MSNs(400 μg/mL)组和NAC(1 μmol/L)组继续孵育24 h。药物刺激结束后，用冷PBS漂洗细胞3 遍，加RIPA裂解液后于冰上收集细胞裂解液，并在冰上放置30 min使其完全裂解，随后4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清作为待测样品，并按照试剂盒说明书进行检测。按上述方法，实验重复3 次。

2.4 细胞线粒体膜电位检测

将细胞置37℃、含5% CO2培养箱中培养24 h，再更换含400 μg/mL MSNs的培养基继续培养0、3、6、9、12、24 h。在NAC预处理的实验中，使用1 μmol/L NAC预处理细胞2 h，然后分成Con组、MSNs(400 μg/mL)+NAC(1 μmol/L)组、MSNs(400 μg/mL)组和NAC(1 μmol/L)组继续孵育24 h。药物刺激结束后，原位装载JC-1，检测用荧光探针。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min后，用JC-1染色缓冲液充分洗涤细胞3 次，尽量去除未进入细胞内的荧光探针JC-1。用荧光显微镜观察，并拍照获取图像。按上述方法，实验重复3次。

2.5 蛋白质印迹分析(western blot)

按本文2.3项下实验结束后裂解细胞，收集上清样品作为总蛋白，线粒体蛋白则按照试剂盒说明书进行提取。BCA法蛋白定量后，将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，用电转膜法将胶中蛋白转移至PVDF膜，封闭后孵育相应的一抗、二抗，于成像系统中显影、分析。采用striping法，对GSK-3β磷酸化蛋白和总蛋白进行分别显影。按上述方法，实验重复3次。

2.6 数据处理及统计分析

各实验组数据以均数±标准差(means±S.D.) 表示，数据统计分析采用系统统计软件SPSS 16.0。多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组内两两比较采用Tukey′s检验；两组之间的比较采用Student′st检验。显著性差异设定为P<0.05。

3 结果

3.1 MSNs的表征

透射电镜结果显示，MSNs分散较均匀，形态较规则，外观呈圆球形，大小均一(见图1(a))，平均粒径为(194.5±23.7)nm(见图1(b))，表明在本实验条件下MSNs能均匀分散在实验溶液体系中。

图1 MSNs的表征。(a)MSNs形态评估的透射电镜图；(b)MSNs粒径分布Fig.1 Characterization of MSNs.(a)Particle size distribution evaluated from the corresponding TEM micrographs;(b)Mean particle size of the ordered mesoporous silica

3.2 对NRK-52E细胞活力的影响

MTT 测定结果显示，用不同浓度0、50、100、200、400、800 μg/mL的MSNs处理NRK-52E细胞24 h后，与Con组(0 μg/mL) 相比，MSNs能显著抑制NRK-52E细胞的增殖(P<0.001)，并呈剂量依赖性，MSNs 孵育24 h的IC50为(438.6±7.1)μg/mL (见图2(a))；在400 μg/mL MSNs作用下，细胞的存活率呈时间依赖性下降(如图2(b))，12 h及24 h细胞的存活率分别为63.37 %± 2.87%和47.57%±2.03%。这表明，MSNs能诱导NRK-52E细胞的毒性，降低其存活。

图2 MSNs对NRK-52E细胞活力的影响。(a)不同浓度MSNs作用24 h后细胞存活率；(b)400 μg/mL MSNs作用不同时间后细胞存活率(数据以平均值±SD表示，与Con组比较，**P< 0.01,***P<0.001,n=3)Fig.2 Effect of MSNs on the cell viability of NRK-52 cells. (a) The cell viability of NRK-52 cells which were treated with various concentrations of MSNs for 24 h; (b) The cell viability of NRK-52 cells which were treated with 400 μg/mL MSNs for different times(Data are presented as the mean±SD.**P<0.01 vs. Cont.***P<0.001 vs. Cont, n=3)

3.3 对NRK-52E细胞氧化应激的影响

图3 MSNs对NRK-52E细胞氧化应激的影响(数据以平均值±SD表示，与Con组比较， *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。(a)细胞内SOD水平；(b)细胞内GSH水平；(c)细胞内CAT水平Fig.3 Effect of MSNs on the oxidative stress in NRK-52 cells (Data are presented as the mean±SD.*P< 0.05 vs Cont,**P<0.01 vs Cont,***P<0.001 vs Cont, n=3). (a) The levels of intracellular SOD; (b) The levels of intracellular GSH; (c) The levels of intracellular CAT

在400 μg/mL MSNs分别作用不同时间0、3、6、9、12、24 h后，采用试剂盒检测细胞浆中的内源性抗氧化物超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢酶(CAT)的活性水平(见图3)。与Con组(0 h)相比，在给药3 h后，细胞内SOD、CAT和GSH水平开始下降，24 h后三者酶活性均呈现显著性下降，其下降率分别为39.74%± 2.23%、51.42%±3.08%、46.05%±3.71%(P< 0.001)。结果显示，MSNs能诱导氧化应激，引起SOD、GSH和CAT消耗增加，活性下降。

3.4 对NRK-52E细胞线粒体功能的影响

MSNs能引起细胞氧化应激、下调抗氧化物活性，过量的活性氧可损伤细胞，攻击线粒体。在400 μg/mL MSNs作用0、3、6、9、12、24 h后，采用JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电势ΔΨm变化。正常情况下，JC-1以聚合体形式存在于线粒体基质中，呈红色荧光；当线粒体膜电势下降至低水平时，JC-1则无法聚集，分解成单体模式，呈绿色荧光。图4结果显示，与Con组(0 h)相比，MSNs能时间依赖性崩解线粒体膜电势ΔΨm，表现为JC-1绿色荧光增强、红色荧光减弱，给药12和24 h后绿色荧光强度显著上升(P<0.001)，表明MSNs可以引起线粒体损伤和崩解。

3.5 对NRK-52E细胞线粒体凋亡途径相关蛋白的影响

图4 MSNs对NRK-52E细胞线粒体功能的影响。(a)线粒体JC-1荧光染色；(b)JC-1荧光定量分析(数据以平均值±SD表示，与Con组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)Fig.4 Effect of MSNs on the mitochondrial function in NRK-52 cells. (a) Fluorescent staining of JC-1 in mitochondria; (b) The quantitative analysis of JC-1 staining(Data are presented as the mean±SD.*P<0.05 vs. Cont.**P<0.01 vs. Cont.***P<0.001 vs. Cont, n=3

图5 MSNs对NRK-52E细胞线粒体凋亡途径相关蛋白的影响。(a)GSK-3β和P-GSK-3β蛋白的western blot条带；(b)GSK-3β和P-GSK-3β蛋白水平的灰度分析；(c)Cyt C和Cleaved-Caspase-3蛋白的western blot条带；(d)Cyt C蛋白水平的灰度分析；(e)Cleaved-Caspase-3蛋白水平的灰度分析(数据以平均值±SD表示，与Con组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)Fig.5 Effect of MSNs on mitochondrial-dependent apoptotic-related proteins in NRK-52 cells. (a) The western blot bands of GSK-3β/P-GSK-3β protein; (b) The gray analysis of GSK-3β/P-GSK-3β protein bands; (c) The western blot bands of Cyt C and Cleaved-Caspase-3 protein; (d) The gray analysis of Cyt C protein bands; (e) The gray analysis of Cleaved-Caspase-3 protein bands(Data are presented as the mean±SD.*P<0.05 vs. Cont.**P<0.01 vs. Cont.***P<0.001 vs Cont, n=3

在400 μg/mL MSNs作用0、3、6、9、12、24 h后，采用Western Blot法分析细胞内蛋白水平的变化情况。与Con组(0 h)相比，MSNs能时间依赖性降低GSK-3β磷酸化水平，而GSK-3β总蛋白含量不受影响(见图5(a))。去磷酸化的GSK-3β为活性状态，能与胞线粒体mPTP的亚基结合，促使其开放增加[15]。给药后3 h，可明显观察到线粒体中的Cyt C经由开放的mPTP从线粒体内释放到胞浆中，且随着作用时间的延长，外释到胞浆内的Cyt C逐渐增加(P<0.001，见图5(b))。漏出的Cyt C能激活下游的Caspase家族，剪切活化凋亡关键蛋白Caspase-3，给药9 h后即可在胞浆中观察到活性状态的Cleaved-Caspase-3(P<0.001，见图4(b))。这表明，MSNs能激活GSK-3β，诱导mPTP开放，促使Cyt C漏出，并活化Caspase-3，引起细胞凋亡。

图6 NAC对MSNs所致NRK-52E细胞毒性的影响。(a)细胞存活率；(b)细胞内SOD水平；(c)细胞内GSH水平；(d)细胞内CAT水平水平；(e)线粒体JC-1荧光染色；(f)JC-1荧光定量分析(数据以平均值±SD表示，与Con组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3Fig.6 Effect of NAC on MSNs-induced cytotoxicity in NRK-52E cells. (a) The cell viability of NRK-52 cells; (b) The levels of intracellular SOD; (c) The levels of intracellular GSH; (d) The levels of intracellular CAT; (e) Fluorescent staining of JC-1 in mitochondria; (f) The quantitative analysis of JC-1 staining. (Data are presented as the mean±SD.*P<0.05 vs. Cont.**P<0.01 vs. Cont.***P<0.001 vs. Cont, n=3)

图7 NAC对MSNs引起NRK-52E细胞内蛋白水平变化的影响。(a)GSK-3β和P-GSK-3β蛋白的western blot条带；(b)GSK-3β和P-GSK-3β蛋白水平的灰度分析；(c)Cyt C和Cleaved-Caspase-3蛋白的western blot条带；(d)Cyt C蛋白水平的灰度分析；(e)Cleaved-Caspase-3蛋白水平的灰度分析(数据以平均值±SD表示，与Con组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)Fig.7 Effect of NAC on the MSNs-changed protein levels in NRK-52E cells. (a) The western blot bands of GSK-3β/P-GSK-3β protein; (b) The gray analysis of GSK-3β/P-GSK-3β protein bands; (c) The western blot bands of Cyt C and Cleaved-Caspase-3 protein; (d) The gray analysis of Cyt C protein bands; (e) The gray analysis of Cleaved-Caspase-3 protein bands. Data are presented as the mean±SD. *P<0.05 vs. Cont.**P<0.01 vs. Cont.***P<0.001 vs. Cont, n=3

3.6 NAC对MSNs所致NRK-52E细胞毒性的影响

NAC是经典的硫醇类抗氧化剂，能清除细胞内的活性氧[16]。1 μmol/L NAC预处理细胞2 h后，分成Con组、MSNs(400 μg/mL)+NAC(1 μmol/L)组、MSNs(400 μg/mL)组和NAC(1 μmol/L)组继续孵育24 h。MTT实验结果显示，与Con组相比，单独给MSNs组中的细胞存活率明显降低。MSNs+NAC组的细胞活力水平在NAC预处理下得到提高，存活率回升至77.38%±3.16%，NAC与Con组之间细胞存活率几乎没太大变化(见图6(a))。同时，抗氧化物活性检测结果显示，NAC组和Con组中的SOD、GSH、CAT酶活性无明显差别，而在MSNs组中被下调的SOD、GSH、CAT酶活性能一定程度被NAC缓解(P<0.01，见图6(b)～(d))。JC-1的检测结果也显示，相比Con组和NAC组，MSNs组线粒体ΔΨm明显降低，而NAC的预处理可以对抗此变化(P<0.01，见图6(e))。Western Blot结果显示，NAC预处理后能明显缓解MSNs所引起的细胞内GSK-3β活化、线粒体Cyt C漏出和Caspase-3剪切激活(P<0.01，见图(7))。这表明，NAC能一定程度对抗MSNs经线粒体途径所致的细胞毒性。

4 讨论

自2001年Vallet-Regi首次将MSNs作为药物递送系统进行载药应用[17]起，MSNs已成功装载多种不同分子量、不同生物医学疗效的亲/疏水性药物[18]，如紫杉醇[19]、阿霉素[20]和地塞米松[21]等，靶向运输至特定的组织和细胞内发挥治疗作用[22-23]。在MSNs的生物医学新应用被不断开发的同时，有越来越多的研究指出MSNs能引起生物体毒性反应，对多种组织器官(如肝脏[4,24]、肾脏[6-7]、肺[9]、脾脏[25]、脑[26]等)造成损伤。药代动力学结果显示，MSNs通过肾脏途径排泄，进入肾脏后经肾小球滤过，由肾小管、集合管排出，因此会高浓度地富集于肾脏中，而蓄积浓度过高往往是引起毒性的诱因[27-29]。因此，本研究选用NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞作为体外模型，探讨MSNs对肾脏细胞的影响。MTT实验结果发现，MSNs能浓度、时间依赖性抑制NRK-52E细胞的增殖活性，诱导细胞死亡。

ROS是氧自由基的统称，如超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢和臭氧等，能攻击细胞内膜结构，破坏稳定性，引起细胞损伤[30-31]；参与多种疾病状态的发生，如肾功能恶化和急性肾小管坏死等[32-33]。研究人员发现，不同种类大小的MSNs能在多种细胞中诱导ROS堆积，引起氧化应激损伤[4,6-7,26]。本实验中的酶活性检测也表明，在MSNs的作用下，NRK-52E细胞内的抗氧化物SOD、GSH和CAT水平显著下调，而SOD、GSH和CAT是机体内重要的抗氧化剂，在维持细胞氧化还原的稳态中起着重要作用。这说明，MSNs能够诱导肾细胞出现毒性，为了研究此毒性反应的机理，本研究将氧化应激损伤作为靶点进行探讨。

GSK-3β是一种普遍存在于动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，能参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞分化、细胞凋亡及胰岛素反应等。它能磷酸化30 余种底物，其功能与活性受控于自身Ser9 和Tyr216的磷酸化，磷酸化后的GSK-3β失去活性[14,34]。本实验结果显示，MSNs能时间依赖性降低GSK-3β磷酸化水平，而不影响GSK-3β的总蛋白含量，表明NRK-52E细胞中的GSK-3β活性显著上升。mPTP是由位于线粒体内/外膜上以及基质内的多种蛋白组成的非选择性高导电性复合孔道[35]，由电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anionchannel, VDAC)、亲环蛋白D (cyclophilin D, CyPD)和腺苷酸转位蛋白(adenine nucleotide translo-cator, ANT)等组成[15,35]。ANT、VDAC是两个主要亚基，P-GSK-3β和ANT形成复合体，可以减少ANT- CyPD抑制mPTP开放，而去磷酸化后活化的GSK-3β能与胞线粒体mPTP的VDAC结合，促使其开放增加[36-37]。mPTP过度开放能引起线粒体膜电势崩解，干扰呼吸链功能，使ATP合成受阻，释放线粒体内蛋白，导致线粒体功能紊乱，促使ROS大量生成；而过量的ROS又能攻击mPTP的亚基，加剧线粒体损伤[35,38]。本实验观察到MSNs能引起线粒体膜电势崩解，线粒体内蛋白Cyt C外释，提示GSK-3β或是通过作用于其下游的mPTP来调节氧化应激，诱导细胞损伤。由线粒体mPTP开放而漏到胞浆中的Cyt C能激活其下游的Caspase家族，通过剪切活化凋亡关键蛋白Caspase-3来诱导细胞凋亡，这一状况也在本实验中被观察到。

为了进一步明确MSNs肾毒性的关键因素，寻求减低毒性的方法，本实验采用了抗氧化剂NAC来预先处理细胞，利用其清除细胞内的活性氧的能力来干预MSNs引起的氧化应激。NAC能降低华法林引起的肾皮质氧化蛋白的水平，防止血肌酐呈剂量依赖性增加，并且加速肌酐水平恢复，减轻急性肾损伤[39]。NAC还可以激活Nrf2通路，清除细胞内ROS，降低MDA水平，减少肾缺血再灌注引起的肾小管上皮细胞凋亡[40]。本实验也观察到，在预先使用 NAC处理的NRK-52E细胞中，MSNs所下调的SOD、GSH、CAT酶活性水平能在NAC作用下被显著恢复，降低的细胞线粒体ΔΨm也能得到明显回升，细胞的氧化应激损伤得到一定程度缓解。在亨廷顿病的小鼠中，NAC能改善神经细胞中线粒体功能，减轻线粒体脂质过氧化，减少ROS生成，下调胞浆内Cyt C水平，抑制Caspase-3和P53激活，减少细胞凋亡，并恢复神经元正常形态[41]。本实验也发现，NAC预处理后能明显地缓解MSNs所引起的细胞内GSK-3β活化、线粒体Cyt C漏出以及Caspase-3剪切激活，细胞存活率也较MSNs组有所增加。这说明，NAC或可干预MSNs诱导的GSK-3β信号通路活化，亦或清除细胞内的ROS，从而改善细胞线粒体功能障碍，降低线粒体膜通透性，减少Cyt C漏出，抑制Caspase-3家族激活。

综上所述，介孔二氧化硅纳米材料(MSNs)可以激活GSK-3β信号通路，诱导NRK-52E细胞线粒体功能障碍，引起氧化应激，对细胞产生毒性。N-乙酰半胱氨酸(NAC)能通过减轻氧化应激损伤，抑制GSK-3β活化，缓解MSNs诱导的NRK-52E细胞毒性，为MSNs在临床上的安全应用提供试验依据。此外，由于MSNs影响线粒体功能的因素复杂多元，因此尚需后续实验进一步探讨、验证。