基于双光子共聚焦成像的大鼠小梁网三维重建及有限元分析

张 静 钱秀清 张海霞 任 琳 刘志成

(首都医科大学生物医学工程学院， 临床生物力学应用基础研究北京市重点实验室， 北京 100069)

引言

青光眼是一组以视乳头萎缩及凹陷、视野缺损及视力下降为综合表现的疾病[1]。它是全球第二大致盲眼病，造成的视功能损伤不可修复，与致盲原因第一位的白内障相比，对人类健康的影响更为严重[2]。有研究分析预测，2040年全球范围内约有1.2亿人会受到青光眼疾病的影响[3]。可见，青光眼这一严重影响患者生活质量的症候群不容忽视。目前，青光眼的发病机制尚不明确，病理性眼压升高被公认为是其发生和发展的主要危险因素之一。眼压是眼球内容物作用于眼球内壁的均衡压力，正常眼压值在10～21 mmHg之间。如果患者的眼压超过了眼底视网膜视神经所能承受的限度，就会引起眼底视神经损伤，出现视功能损害，如不及时治疗，视野就会逐渐丧失直至失明[4]。因此，控制眼压、保护眼底功能是青光眼治疗的追求目标。生理性眼压的稳定性，主要依赖于房水生成量与排出量的动态平衡，任何因素使得房水循环的动态平衡被破坏都可以导致眼压升高。眼压升高的病理生理过程主要有房水生成速率的增加、表层巩膜静脉压升高以及房水外流阻力增大这3个方面。目前认为，临床上绝大部分的高眼压形成是由于房水流出阻力增加所致。有研究表明，高眼压形成与小梁网通道外流阻力的增加密切相关，而这一外流阻力主要来源于小梁网组织和Schlemm管区域[5]。由此可见，高眼压对于小梁网形态的影响研究十分必要和迫切，能够为房水流出障碍形成的机制研究提供有价值的形态学信息。

小梁网组织内嵌于巩膜沟内部，由相互联结的小梁组成的多孔网状结构，小梁为胶原和弹性纤维组织。一方面，鉴于小梁网结构复杂且尺寸微小，成像技术需要达到微米量级的空间分辨率才能准确获取小梁网的结构信息；另一方面，小梁网位于角巩膜缘下方的虹膜根部，组织成像时表层巩膜的散射较大。正是由于小梁网解剖位置的影响，成像设备需要有足够的成像深度才能实现跨巩膜成像。目前常用的成像技术很难同时满足这两方面的要求，如电子显微镜所能达到的空间分辨率较高，但成像深度较小。而利用光学相干断层成像技术[6]和超声生物显微镜[7]获取的小梁网区域图像数据，由于分辨率较低，使得获取小梁网微观结构信息受到局限。由于双光子显微镜具有亚细胞级别的分辨率及其能够获得深层组织结构和功能信息的能力，使其在基于实验的生物医学成像方面得到越来越广泛的关注[8]。Gonzalez等[9-10]利用双光子激发荧光对人眼小梁网组织进行成像，得到了较为清晰的小梁网组织自发荧光图像，从中可以看到角巩膜小梁网属于片状荧光带。Masihzadeh等在共聚焦成像设备前加上前房角镜对猪眼小梁网进行成像，获取了不同方位的小梁网图像数据，并将获得的图像数据拼接成了立体形态图[11]。国内外学者对于小梁网形态学的研究一直都在前行的路上，但是到目前为止，关于小梁网的三维形态结构随眼压变化的规律还鲜见报道。本研究利用双光子共聚焦成像技术对小梁网进行原位成像，获得了正常眼压和高眼压下小梁网的微观结构信息。并通过图像处理的方法，定量分析了不同眼压下小梁网孔隙率随深度变化的规律。本研究基于共聚焦断层图像，三维重建获得了小梁网细观结构有限元模型，通过对模型进行有限元分析，获取不同压力下小梁网的变形云图，得出小梁网最大变形部位以及最大变形值。综上所述，本研究采用实验与数值模拟相结合的方法去研究具有复杂结构的小梁网组织，综合分析了眼压对小梁网形态学的影响，为青光眼发病机制以及降眼压治疗方法研究提供有价值的形态学信息。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物为SPF级SD大鼠，体重320～350 g，雌雄不限，由首都医科大学实验动物中心(IACUC:AEEI-2013-x-123)提供。将6只大鼠随机分成两组，未加压组3只大鼠用来作为空白对照组。高眼压组利用吊瓶悬挂加压的方式，分别给每只鼠左眼加压60 mmHg，右眼作为未加压对照组。维压24 h后，将大鼠安乐死后取出眼球，然后将新鲜眼球置于4℃福尔马林溶液中浸泡12 h固定，最后将眼球置于PBS缓冲液中保存备用。

1.2 方法

1.2.1成像系统

双光子共聚焦成像系统由中国科学院深圳先进技术研究院自行搭建，使用可调锁模激光器，激发光源Ti为蓝宝石激光，140 fs脉冲，频率80 MHz，激发波长950 nm，685 nm的二向色镜置于物镜前，用来将二次谐波信号反射到PMT上，在PMT前放置有一个680 nm波长的滤波器和一个带通滤波器。成像过程中通过触动器来控制聚焦深度。

1.2.2图像处理及三维模型建立

利用双光子共聚焦成像设备采集小梁网组织的图像数据，获取的断层图如图1(a)所示。首先，利用Matlab软件对图像进行格式转换，并对获取的数据集进行裁剪和图像增强处理，使得小梁网区域的孔隙和黑色背景的灰度值处于不同的范围；然后，根据处理后图像的灰度直方图分别获得孔隙和小梁网的灰度值范围，从而计算得出小梁网的孔隙率，即孔隙的面积占整个小梁网区域的百分比。对于小梁网三维模型的建立，首先将预处理后的共聚焦断层图导入Mimics14.0(Materialise Corporation，比利时)软件中进行重建工作，使用软件中阈值分割和区域增长以及编辑每张序列图等工具，获得的小梁网及其周围组织的三维模型如图1(b)所示；然后，将模型导入Solidworks(Dassault Systemes SA，法国)软件中进行优化(见图1(c))；最后，利用ANSYS 14.0(ANSYS Corporation，美国)软件对模型进行模拟分析。

图1 小梁网组织的三维重建。(a)小梁网断层序列图；(b)Mimics重建的小梁网模型；(c)优化后的模型Fig.1 3D reconstruction of the trabecular meshwork. (a)The tomographic sequence images of trabecular meshwork; (b)3D model of the trabecular meshwork using mimics; (c)The optimized model of the trabecular meshwork

1.2.3小梁网有限元模型

将小梁网模型导入有限元软件ANSYS 14.0进行网格划分，采用四面体网格类型，设定小梁网的网格尺寸为8 μm。网格划分后的单元总数为849 162，节点总数为1 227 431，划分结果如图2所示。小梁网组织的材料选用线弹性不可压缩材料，泊松比设为0.49，杨氏模量设为162 Pa[12]。将小梁网模型中邻管组织区域以及Schlemm管远离小梁网的一侧所有面设为空间固定面。同时在小梁表面的所有面施加均匀载荷，方向与房水外流的方向一致(图2所示，沿Z轴负方向)，这是为了模拟不同眼压与巩膜静脉压之间的压力差对小梁网组织的作用[13]。

图2 小梁网模型的网格划分、边界约束以及压力条件Fig.2 The trabecular meshwork model after the meshing, boundary constraints and pressure

1.2.4有限元模型的验证

为验证有限元模型的有效性，将模拟计算的结果与实验测量的结果进行比较。由于ANSYS软件的后处理功能只能给出单个点的变形值，因此需要监测小梁网模型上下表面点的相对变形来确定不同眼压下组织厚度的变化。通过这种方法，在有限元模型上依次找到小梁网组织前表面的测量点以及邻管组织与Schlemm管交界处的测量点在模型中的位置，并监测不同眼压下小梁网的厚度变化情况。对于实验测量结果，在高眼压情况下(60 mmHg)，小梁网组织由于被挤压而变得致密，总的厚度明显变薄(厚度小于40 μm)。正常眼压条件下，小梁网厚度值为(66.4±5.14)μm(P<0.001 )。

为验证有限元分析的可靠性，在ANSYS软件的后处理中探测小梁网和Schlemm管交界线对应点和小梁网前表面对应点的变形差来确定不同眼压下小梁网组织的厚度变化(不同压力条件下，厚度变化小于30 μm)。将有限元计算的结果与实验测量结果进行比较，眼压升高后，小梁网组织的厚度均呈变薄的趋势，误差也在可接受的范围内，因此认为模型的计算是合理的。

2 结果

2.1 高眼压下小梁网形态

图3为获取的小梁网局部区域的形态图，其中(a)取自未加压情况，可以看到小梁网纤维排列较为规则，孔隙明显。对于加压60 mmHg的情况，一些小梁被压缩，甚至有些小梁网胶原纤维发生断裂(见图3(b))。将加压组左右两图进行对比分析，可以发现深层小梁网组织损伤的程度较弱，而距离前房较近的组织断裂损伤比较明显。眼内压增高会引起小梁网组织结构异常，主要表现为小梁发生弯曲或塌陷。这一压力升高所导致的组织解剖结构异常会使房水流出阻力发生变化，影响房水的排出。

图3 局部小梁网形态图(左图和右图分别取自深度为30和20 μm处图像(小梁网内侧设为0 μm)，箭头为压缩区域，三角为断裂区域，比例尺：20 μm)。(a)正常眼压；(b)高眼压条件下(60 mmHg)Fig.3 The morphological images of the local TM(This TPM image was obtained at a depth of 30 μm (the left) and 20 μm (the right) below the TM inner layer, and the arrow indicates the location of compressed area and the triangle symbol refers to the fracture area, scale bar=20 μm). (a) In the normal eye; (b)In the pressurized eye of 60 mmHg.

2.2 小梁网孔隙率随深度变化

图4 不同眼压下小梁网孔隙率随深度变化折线图Fig.4 Curves of trabecular meshwork porosity with image depth at different intraocular pressures

图4为正常眼压和高眼压条件下小梁网孔隙率随深度的变化曲线。可以看出，无论加压与否，小梁网孔隙率均随着深度的增加而增大的趋势是一致的，这与小梁网的三层结构(临管组织、角巩膜小梁网以及葡萄膜小梁网)的形态变化趋势相适应。即从小梁网远端看向近端，随着深度的增加孔隙逐渐变小，房水外流阻力逐渐减小。由曲线图看出，距角巩膜缘200 μm深度时，加压后小梁网的孔隙率明显小于未加压时的孔隙率。这是由于加压使得小梁网胶原纤维坍塌，组织被压缩变薄，因此孔隙率较小的深层小梁网出现在200 μm深度处。而对于未加压情况，小梁网形态在200 μm对应于靠近前房的浅层小梁网，其孔隙率远大于离角巩膜缘更近的深层小梁网组织。

2.3 模拟结果云图

图5为不同压力下小梁网模型的变形云图。有限元分析结果显示，小梁网的最大形变位置出现在孔隙较密集的地方，即图5红色标记所在的区域。其中(a)和(b)分别给出小梁网在40和100 Pa压力差作用下的变形云图，不难发现小梁网的最大变形均出现在孔隙多的区域。本研究分析了10个不同的压力差(从40～220 Pa，间隔为10 Pa)，得到了小梁网区域-Z方向(房水外流的方向)的最大变形值随压力的变化趋势(见图6)。压力差为40 Pa得到的小梁网最大形变值为0.004 2 mm。而当模拟压力差设增加到180 Pa时，方向形变的最大值可达到0.019 mm，已达到浅层小梁网孔隙的尺寸。可以看出，若小梁网组织存在于压力差为180 Pa左右的环境，小梁网组织损伤的风险非常大。

图5 不同压力下小梁网的变形云图。(a)压力差为40 Pa；(b)压力差为100 PaFig.5 Deformation cloud of the trabecular meshwork under different pressures.(a)With the pressure of 40 Pa;(b)With the pressure of 100 Pa

图6 小梁网-Z方向最大变形值随模拟压力变化折线图Fig.6 Graph for the value of the maximum deformation of the negative Z directionwith different simulated pressures

图7为小梁网变形后的分布，选取局部区域并放大，与同一区域变形前云图对比来看，可以清楚地看到小梁被挤压变形的情况。在模拟计算分析中，随着模拟压力的增加，小梁组织变形程度也会加剧。综合分析得出高眼压会使得小梁受压塌缩变形，尤其是孔隙较密集区域，组织结构变化后会影响小梁网处房水正常地排出眼外，即影响了小梁网通道上的外流阻力。

图7 小梁网变形后云图(模拟压力差为100 Pa)，右图是将左图方框区域放大4倍后变形前后的结果Fig.7 The real deformation of trabecular meshwork with the simulated pressure in 100 Pa. The right are the amplified pictures (4×) of the area in the left box before deformation (up) and after deformation (bottom)

3 讨论与结论

房水主要通过前房角处的小梁网组织进入Schlemm管，再依次通过集合管、房水静脉和巩膜表面的睫状前静脉，最后回流到体循环[14]。由于小梁网的解剖位置和微小尺寸的影响，对其微观结构的获取具有一定的难度。基于前节光学相干断层成像术和超声生物显微镜等能实现一定深度组织的成像，但其空间分辨率不足以获取小梁网的微观结构信息[15-16]。近年来，随着光学显微成像技术的发展，无论是在分辨率还是探测深度方面，都取得了巨大成功，涌现了一批创新技术。有研究利用光谱双光子显微技术对房水外流通道进行成像，获取到了Schlemm管、集合管、巩膜静脉等图像数据，并通过定量评估给出了Schlemm管、集合管、巩膜静脉的尺寸范围[17]。双光子显微镜带有超高灵敏度的直接探测器，具有记录组织深层最细微的内部结构的能力，已广泛应用于生物医学成像研究。目前认为，双光子显微成像技术是观察小梁网和Schlemm管结构极为有效的研究工具。

双光子共聚焦成像技术(包括双光子自体荧光和二次谐波信号)，可以在不破坏房水流出通道的前提下对小梁网通道组织进行原位成像，较为真实地反映小梁网通道微观结构信息。本研究基于双光子共聚焦成像技术直接对眼组织进行成像研究，避免了使用染色剂以及对组织进行切片的操作，减少对小梁网组织造成一些实验技术上的损伤，从而使得获取的成像数据更加接近小梁网的真实形态。本研究所依托的双光子成像系统使用的是950 nm的激发波长，在有效降低巩膜组织散射、显著提高成像深度的基础上，系统分辨率依然可达到0.5 μm，使得获取的小梁网微观结构较为清晰。

临床证据显示，高眼压是房水外流通道阻力增加的重要影响因素。实验证据指出，流出阻力的主要发生部位主要位于小梁网区域，包括Schlemm管的内壁[5]。此外，还有研究表示流出阻力的增加是由于小梁网的结构异常或功能改变造成的[18-19]。Ernst等的研究曾指出，小梁网通道的结构、组织成分和材料特质等都直接影响房水的外流阻力[20]。学者们在房水流出受阻影响因素方面做了许多研究，到目前为止，眼压升高仍然是青光眼最为关键的危险因素。虽然目前认为房水的流出受阻于小梁网通道是导致眼压升高的主要原因，但造成外流通路上房水流出受阻的确切部位和机制还没有确切的答案，从而影响治疗措施的制定。由此可见，获取小梁网的三维细观结构，特别是不同压力下小梁网的三维形态结构有助于提升我们对小梁网通道外流阻力形成的形态学认识，为通过提高房水流出效率缓解高眼压的临床治疗方法研究奠定形态学基础。

McEwen等最早的工作是将小梁网视为产生外流阻力的单一组织，由一个简单的各向同性通道构成[21]。而之后的研究也多将小梁网假设为多孔介质，并且由胶状材料填充[22]。例如，Villamarin等基于人眼组织切片建立了眼前节房水流动模型，其中的小梁网模型是一块网状组织，模拟研究通过将小梁网假设为多孔介质进行分析[23]。然而，小梁网组织的孔隙结构是不均匀分布[24]，孔径大小不一，那么将小梁网假定为多孔介质获得的研究结果可能与实际状况有一定的差距。为了更为清晰准确地观察小梁网孔隙结构，基于共聚焦断层图重建出了小梁网细观结构模型。通过有限元方法分析了不同压力对小梁网结构变化的影响，发现加压会使小梁网微观结构中的小梁扭曲变形，孔隙密集区域变形较为严重。本研究分析了大鼠小梁网的孔隙率随深度的变化规律，结果表明，小梁网孔隙率随着深度的增加是逐渐增大的，即浅层小梁网孔隙率较大。实验结果表明，浅层小梁组织(孔隙较多区域)损伤程度较严重，这说明模拟计算结果与实验数据给出的结果是一致的。

综合分析实验和模拟的结果得出：眼压升高后，小梁网的结构会发生一定程度的塌缩变形，小梁网形态结构的变化可能是导致房水流出阻力增大更重要的影响因素，这在一定意义上为研究和治疗青光眼提供有价值的形态学信息，并为房水流出障碍形成机制的研究提供了可参考的依据。但是，本研究也有很多不足之处，如小梁网模型的力学特性被定义为线弹性材料，但软组织多是非线性材料。所以，在以后的研究中，会考虑将小梁网设为非线性材料，以期为临床提供更可靠的理论依据。小梁网与Schlemm管以及集合管、巩膜静脉是房水外流的主要通道，它们是一个整体，目前的研究仅考虑小梁网处的受力以及变形情况，接下来的研究会考虑将整体通道的形变与压力结合，从整体上研究房水外流通道与阻力之间的关系。可以相信，在充分认识小梁网细观结构的基础上，能为下一步构建小梁网外流通道模型提供有价值的形态学信息。而且通过实验与模拟计算相结合的方法获得小梁网变形与高眼压之间的关系，也为探究高眼压对小梁网房水流出阻力的影响研究提供了新的视角。

(致谢：感谢中国科学院深圳先进技术研究院费雷寰和李慧在实验中给予的帮助)