羽扇豆醇对肝癌细胞的作用及其机制研究*

史春雨 陈红红 景 婷 陈楚言 莫名月 罗焕敏 高劲松

原发性肝癌为我国最常见的恶性肿瘤之一，也是世界性最高发的癌症之一[1]。近几十年来全世界肝癌的发病率、死亡率呈不断上升趋势，但目前肝癌的临床治疗效果并不乐观，存在手术治疗费用昂贵且预后差，化疗副作用大等问题。因此从肝癌的发病机制入手，寻找新的具有抗癌作用的生物活性分子，必将给原发性肝癌的治疗带来突破[2]。羽扇豆醇属于三萜类化合物，分子式为C30H50O，分子量为426.72，它广泛存在于多种水果、蔬菜和中草药等植物中。大量研究表明，羽扇豆醇具有抗癌效应，对机体器官和组织细胞如肝脏和心脏具有保护作用，且表现出了对肿瘤细胞的选择性[3，4]。本项目旨在通过研究其对p38-MAPK信号通路特异性靶点的影响，探讨其对肝细胞癌的抑制作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：12只4-5周龄的SPF级BALB/C雄性裸鼠，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：44007200030605。所有小鼠饲养条件均为昼夜各半，食物饮水不限制，室温，55% 湿度。

1.1.2 细胞：HepG2细胞和Huh7细胞，由广州莱德尔生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要试剂：羽扇豆醇(Lupeol)(美国Sigma公司)；细胞培养试剂：胎牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30087.01)；RPMI-1640培养基(Hyclone公司，Cat.No.SH30809.01B)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；链霉素(Hyclone公司，Cat.No. SH30010)；PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone公司，Cat.No.SH30256.01B)；单溶液细胞增殖检测试剂cellTiter96AQ(Promega，Cat.No.G3582)；SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen公司)；HRP标记的GAPDH优质内参(上海康成生物有限公司，货号为KC-5G5)；一抗(Abcam)；二抗：兔抗鼠IgG (H+L)(Southern Biotech公司，货号为6170-05)、山羊抗兔IgG (H+L Chain Specific)(Southern Biotech公司，货号为4050-05)、过氧化物酶标记兔抗山羊IgG(武汉博士德生物工程有限公司，货号为BA1060)、过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司，货号为BA1058)；发光液Immobilon Western Chemilum HRP Substrate(Millipore公司，货号为WBKLS0500)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Keygen，货号KGA106)； Opti-MEM培养基(Gibco，批号为31985-070)；LipofectamineTM2000转染试剂(invitrogen，批号为 11668-019)；所用荧光素酶报告基因载体质粒pGL3-Basic及pGL3-ERK1/2-promoter由载体组提供。

1.1.4 主要仪器：细胞恒温培养箱(Thermo Scientific, HERACELL150i) ；倒置荧光显微镜(Leica，型号为DMI6000B)；艾本德核酸蛋白测定仪(德国，BioPhotometer Plus)；实时荧光定量PCR仪(ABI PRISM®7500 Sequence Detection System)；苏州安泰洁净工作台(SW-CJ-IFD)； 低速离心机(中佳，SC3614)；倒置光学显微镜 (OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2)；流式细胞仪(BD FACS Calibur)； 酶标仪(Thermo Fisher Scientific，型号为Multiscan MK3)；Luciferase活性检测系统为Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司，E1910)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模：小鼠适应性喂养1周后随机分为HepG2小鼠对照组、HepG2小鼠羽扇豆醇组、Huh7小鼠对照组及Huh7小鼠羽扇豆醇组，每组3只。分别将细胞密度为 1×106/ml 的HepG2、Huh7细胞悬液接种于对应组的裸小鼠背部皮下，细胞悬液接种量均为 0.1ml，接种后随时观察肿瘤的增长情况。根据前期实验筛选确定本研究中小鼠的羽扇豆醇治疗剂量为0.5mg/只。接种细胞14天后，分别对HepG2小鼠羽扇豆醇组和Huh7小鼠羽扇豆醇组进行腹腔给药，剂量为0.5mg/只，其余组则予等量生理盐水，连续给药14天。

1.2.2 肿瘤标本采集与检测：待肉眼能观察到肿瘤时，开始用微米卡尺测肿瘤体积，每周测量2-3次。按以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=[(长径×短径2)/2(mm3)]，末次给药 24h后，采用脱颈法将小鼠处死，取其皮下肿瘤组织称重，-80℃冻存，待用。

1.2.3 细胞培养和分组:将人肝癌 HepG2和Huh7细胞株用含10%小牛血清、青链霉素各100μ/ml的RPMI 1640培养液在37 ℃, 5% CO2,湿度为90%的培养箱中进行培养。分别使用4mg/L的顺铂、二甲基亚砜、60mg/L的羽扇豆醇处理HepG2与Huh7细胞株24h，用于后续实验，分别记为HepG2顺铂组、HepG2溶剂组、HepG2羽扇豆醇组和Huh7顺铂组、Huh7溶剂组、Huh7羽扇豆醇组，未作其它处理的细胞为HepG2对照组和Huh7对照组。

1.2.4 MTS法检测细胞增殖：分别离心收集各组细胞接种于含RPMI 1640培养液的96孔板上(细胞浓度为1×105个/ml)，每孔100μl，每组设3个复孔,于5% CO2、37 ℃条件下培养。分别于培养0h、24h、48h和72h加入单溶液细胞增殖检测试剂，每孔10μl。孵育4h后加入 DMSO,MTS检测读取各个时间点490nm处吸光度(OD)值。重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡：用2ml的PBS缓冲液洗涤各组细胞2次，1 000g离心5min，弃去上清液，加入0.5ml的0.25%胰酶消化孵育，加入含血清的培养基并进行细胞计数，使得密度大约为1×106个/ml。各组取0.5ml细胞悬液加入1.25μl的Annexin V-FITC，室温(18-24℃)避光反应15min后，室温1 000g离心5min，弃去上清液。再用0.5ml预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬，加入10μl的Propidium Iodide后置于冰上避光保存，立即用流式细胞仪检测分析。

1.2.6 质粒构建、转染及荧光素酶实验检测细胞活性：将p38相关基因的promoter关键区域克隆至pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体，测序结果经BLAST分析证实基因ERK1/2 promoter已成功克隆至pGL3-Basic载体中，用于后续实验，质粒为：pGL3-ERK1/2-promoter。取对数期、生长状态良好的细胞, 接种于含RPMI 1640培养液的24孔板上(细胞终浓度为5×104个/ml),每孔100μl,于37℃、5% CO2条件下培养24h后,每孔吸取pGL3-ERK1/2-promoter质粒母液(0.5 μg/μl)2μl溶解到250μl的Opti-MEM培养基为A液，取4μl的 LipofectamineTM2000溶解于Opti-MEM培养基混合5min为B液，将A液和B液混合，静置20min后加到细胞培养板中进行转染。转染后4h换为含10%FBS的MEM培养基培养。转染48h后，收样进行双荧光检测。

1.2.7 qRT-PCR检测mRNA表达：用TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，将合格RNA样品进行cDNA反转录。取1.0μg的RNA作为模板反转录合成cDNA，以此为模板进行qPCR反应，以18srRNA作为内参基因,检测丝裂原活化蛋白激酶超家族相关基因p38、ERK1/2、JNK、C-jun、MEKK1、c-MYC的mRNA相对表达量。各引物序列如表1所示。qPCR反应程序为:50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 32s读板，40个循环。以Ct法表示目的基因的相对表达量,每组样品设3个重复,实验重复5次。

表1 检测片段大小及引物序列

1.2.8 Western blotting检测蛋白质表达：各组细胞分别加入裂解液充分裂解，14 000r/min 离心15min，取上清提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒进行定量，SDS-PAGE电泳分离后进行聚偏乙烯( PVDF) 膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗按 1∶1 000的比例稀释后4 ℃孵育过夜，分别加入二抗：兔抗鼠 IgG (H+L)(1∶4 000)、山羊抗兔IgG (H+L Chain Specific)(1∶5 000)、过氧化物酶标记兔抗山羊IgG (1∶3 000)、过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG(1∶2 000)室温孵育1h，增强型化学发光(ECL)显影，免疫印迹条带应用 Quntity One 4.62软件进行定量分析。实验重复3次。以GAPDH作为内参，以目的蛋白与GAPDH蛋白条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠体内肿瘤质量和体积比较

实验第28天，与HepG2小鼠对照组比较，HepG2小鼠羽扇豆醇组肿瘤质量显著减轻(t=14.63，P<0.01)；与Huh7小鼠对照组比较，Huh7小鼠羽扇豆醇组肿瘤质量显著减轻(t=11.02，P<0.01),见表2。而且羽扇豆醇作用的HepG2、Huh7组小鼠肿瘤体积于第17天、第20天、第23天及第26天时均显著小于同细胞对照组(P<0.05)，见表3。

表2 不同实验组小鼠肿瘤质量均=3)

表3 各组小鼠肿瘤体积比较均=3)

2.2 各组细胞增殖比较

0h时，HepG2细胞各组以及Huh7细胞各组增殖情况差异无统计学意义(P>0.05)。与HepG2对照组和Huh7对照组比较，HepG2溶剂组和Huh7溶剂组各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0. 05)，而HepG2和Huh7顺铂组和羽扇豆醇组24h、48h、72h的细胞增殖显著被抑制(P<0. 05)，且顺铂组抑制作用较羽扇豆醇组更显著(P<0. 05)。见表4。

表4 不同实验组细胞的增殖比较(OD值，均=3)

2.3 各组细胞凋亡率比较

HepG2细胞各组以及Huh7细胞各组细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。与HepG2对照组和Huh7对照组比较，HepG2溶剂组和Huh7溶剂组细胞凋亡率差异无统计学差异(P>0. 05),而HepG2羽扇豆醇组、顺铂组和Huh7羽扇豆醇组、顺铂组细胞凋亡率均升高(P<0. 05)，但羽扇豆醇组细胞凋亡率的升高不及顺铂组(P<0. 05)。见图1、表5。

图1 各组细胞凋亡率(流式细胞术)

表5 各组细胞凋亡率比较均=3)

2.4 各组细胞ERK1/2启动子荧光活性比较

与同细胞对照组转染pGL3-Basic质粒比较，转染pGL3-ERK1/2-promoter 质粒对照组的荧光活性增强(P<0. 05)，而与同细胞对照组转染pGL3-ERK1/2-promoter 质粒比较，羽扇豆醇处理组的ERK1/2启动子荧光活性降低，表现为一定的抑制作用，且差异有统计学意义(P<0. 05)，但与同细胞羽扇豆醇组转染pGL3-Basic质粒比较，转染pGL3-ERK1/2-promoter 质粒羽扇豆醇组的ERK1/2启动子荧光活性增强，且差异有统计学意义(P<0. 05)。见表6。

表6 不同实验组细胞的启动子活性检测均=3)

2.5 各组细胞相关mRNA水平比较

HepG2细胞各组以及Huh7细胞各组 p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC mRNA水平差异均有统计学意义(P<0. 05)。与HepG2对照组和Huh7对照组比较，HepG2溶剂组和Huh7溶剂组p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC mRNA水平均无统计学差异(P>0. 05)，而HepG2羽扇豆醇组、顺铂组和Huh7羽扇豆醇组、顺铂组p38、MEKK1 mRNA水平均升高，ERK1/2、JNK、c-Jun、c-MYC mRNA水平均降低(P<0. 05)，但羽扇豆醇组相关mRNA水平升高或降低均不及顺铂组明显(P<0. 05)。见表7。

表7 各组细胞相关mRNA表达水平比较均=3)

2.6 各组细胞中相关蛋白表达水平比较

HepG2细胞各组以及Huh7细胞各组p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0. 05)。与HepG2对照组和Hun7对照组比较，HepG2溶剂组和Hun7溶剂组p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0. 05)，而HepG2羽扇豆醇组、顺铂组和Huh7羽扇豆醇组、顺铂组p38、MEKK1蛋白水平升高，ERK1/2、JNK、c-Jun、c-MYC蛋白水平均降低(P<0. 05)，但羽扇豆醇组相关蛋白水平升高或降低不及顺铂组明显(P<0. 05)。见图2、表8。

图2 各组细胞相关蛋白表达(Western blotting)

表8 各组细胞中相关蛋白表达水平比较均=3)

3 讨 论

细胞凋亡又被称为程序性细胞死亡，在肿瘤的发生发展和治疗中起到重要的作用，通过诱导和调控凋亡通路来诱导肿瘤细胞凋亡是目前治疗肿瘤的一个重要途径。丝裂原活化蛋白激酶超家族(MAPK)是一族含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶，广泛的分布于细胞浆内，可将细胞外刺激信号传递到细胞核，是引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的重要信号传导系统。目前MAPK超家族在哺乳动物中至少发现3种亚家族，分别为细胞外信号调节激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶。MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，以三级激酶级联的形式(MAPKKK-MAPKK-MAPK)转导信号。它们拥有各自的底物和调节蛋白激酶，接受不同的信号刺激[5，6]。许多抗肿瘤药物都是通过诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肝癌效应的，在体外用顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的实验中发现肝癌细胞的细胞质和细胞核中MAPKs(JIN/SAPKs, p38 MAPK, ERK)及转录因子(JUN，CREB)均有明显表达[7]。羽扇豆醇是一种存在于多种植物中的天然成分，有大量的研究表明，羽扇豆醇对宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多种肿瘤均显示出抗癌活性,且研究发现一定剂量的羽扇豆醇还可以逆转致癌物对大鼠肝脏的损害，拮抗化疗药对大鼠心脏的毒性[8-10]。Bhattacharyya等[11]的一项研究显示，羽扇豆醇单独或与化疗药物联合使用在头颈肿瘤的治疗中均具有一定的抑制作用。在口舌基底细胞癌裸鼠模型中，研究显示羽扇豆醇增强了肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性[12]。另外，有发现证明羽扇豆醇对人乳腺癌、人膀胱癌细胞均具有一定的抑制作用[13，14]。因此，羽扇豆醇是具有极大潜力的天然抗肿瘤药物。在本项目前期预实验发现羽扇豆醇对肝癌细胞HepG2、Huh-7均具有抑制作用，且其抑制作用随着羽扇豆醇的浓度增加而增强。并且同一浓度的羽扇豆醇处理细胞后，发现随着处理时间增加，羽扇豆醇对肿瘤细胞的抑制作用也不断增强。同时还发现经羽扇豆醇处理过的HepG2、Huh-7细胞，细胞内p38的mRNA水平显著上调，且上调水平与羽扇豆醇的浓度具有一定的相关性。本实验中，动物在体实验结果表明羽扇豆醇可以抑制肿瘤细胞的生长；细胞实验结果显示羽扇豆醇处理HepG2、Huh-7细胞后能够从mRNA和蛋白水平提高p38MAPK信号通路中的p38和MEKK1的表达，降低ERK1/2、JNK、 c-Jun和c-MYC的表达，虽然其作用不及顺铂，但较对照组还是显示出了一定的诱导细胞凋亡的作用。综上所述，p38、MEKK1、ERK1/2、JNK、c-Jun和c-MYC参与了羽扇豆醇诱导的HepG2、Huh-7细胞的凋亡，推测羽扇豆醇是通过细胞表面死亡受体途径诱导HepG2和Huh-7细胞凋亡的，从而提示羽扇豆醇在肝癌的治疗中起着潜在的价值，也为人们对羽扇豆醇的深加工开发和合理应用提供科学依据。

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