不同耕作模式对东北黑土微生物群落结构和酶活性的影响

张常仁，杨雅丽，程全国，刘亚军，张春雨，何红波，鲍雪莲，解宏图

(1.沈阳大学 环境学院，辽宁 沈阳 110044；2.中国科学院 沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016；3.辽宁省现代保护性耕作与生态农业重点实验室，辽宁 沈阳 110016；4.吉林省梨树县农业技术推广总站，吉林 梨树136500)

0 引 言

传统耕作(翻耕、旋耕起垄)一直是我国东北地区主要的农业生产方式，高强度的农业耕作使黑土长期处于超负荷利用状态，加之水土流失严重，导致黑土肥力逐年下降，严重影响了黑土地的耕地质量，保护黑土地刻不容缓[1-2]。在农田生态系统中，土壤有机质的积累及其稳定性是衡量土壤质量的核心。东北黑土自开垦以来，土壤有机质的矿化分解过程加速，其含量下降了46%[3]。以减少耕作频率及秸秆还田为核心的保护性耕作可以通过增加外源输入，减少土壤扰动有效地降低自然因素对土壤的侵蚀作用，促进土壤有机质的形成与稳定，有效提升土壤有机质数量和质量，保证土壤的生产和生态功能[4-6]。

土壤微生物作为土壤生态系统中重要的组成部分直接参与土壤有机质的分解和养分的循环转化过程[7]。土壤微生物特性越来越多地被用于评估土壤健康，其生物量和活性表征着土壤质量和有机质迁移转化的活跃程度[8-9]。研究表明，耕作方式影响土壤生物化学特性并最终通过改善土壤微生物群落组成和活性影响土壤有机碳的形成和转化[10]。免耕通过减少扰动增加土壤微生物的生物量，秸秆的输入使这种效果更为显著[11]。秸秆的添加不仅为土壤输入了大量的营养元素还可以改善土壤的理化性质，进而影响土壤微生物的群落结构和功能[12]。多数研究发现，保护性耕作可以增加土壤有机碳的含量[13-14]。但也有研究发现，免耕仅能增加表层几厘米土壤及秸秆还田处有机碳的含量，土壤有机碳在表层的积累具有“饱和效应”[15]。然而，与传统的翻耕相比，长期的免耕及秸秆覆盖还田后土壤性质在耕层的变化如何影响土壤微生物量、微生物群落组成和活性，并且这些变化在不同土壤层次间的差异尚不明确。本研究利用位于吉林省梨树县的长期秸秆覆盖免耕平台，开展不同耕作模式下土壤微生物群落结构和功能的研究，探讨免耕秸秆还田对黑土土壤碳库生物稳定性的提升效果，为农田可持续生产和高效管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验基地概况

试验样地位于吉林省梨树县大房身乡高家村(43°19′N，124°14′E)的中国科学院沈阳应用生态研究所保护性耕作研发基地。该基地始建于2007年，年平均气温为6.9 ℃，降雨量为614 mm，主要集中在6、7、8三个月，气候类型为温带半湿润大陆性季风气候。当地种植模式以玉米连作为主。供试土壤为中层黑土，壤质黏土。本底土壤pH值为7.1，土壤有机碳含量为11.3 g·kg-1，土壤全氮含量为1.2 g·kg-1。

1.2 试验设计

试验小区采用完全随机区组设计，3种不同耕作方式处理，分别为传统耕作(Conventional tillage，CT)、免耕+无秸秆还田(No-tillage without stover，NT-0)、免耕+全量秸秆还田(No-tillage with total amount stover mulching，NT-100)，每个处理4次重复。每个小区面积为8.7 m×30 m。传统耕作(CT)模式为翻耕并全部移除秸秆，免耕播种采用德邦大为免耕播种机(DEBONT型号：2205)操作，其中，免耕处理无秸秆还田(NT-0)在播种前将秸秆全部移除，免耕处理全量秸秆还田(NT-100)在播种前将收获的全部秸秆均匀的覆盖在土壤表面，秸秆长度约为50 cm。免耕处理模式下，除播种外全年不再对土壤进行扰动。各处理的肥料施用量相同分别为：氮(N)240 kg·hm-2、磷(P2O5)110 kg·hm-2、钾(K2O)110 kg·hm-2。

1.3 样品采集与测定

土壤样品于2019年秋季收获后采集，采用土钻法，五点混合取样。采样深度为0～5 cm、5～10 cm和10～20 cm。采集后的样品过2 mm筛，去除可见的石砾、秸秆残渣和根系，一部分保存于4 ℃冰箱用于土壤铵态氮、硝态氮、水溶性碳氮和土壤酶活性的测定；另一部分保存于-20 ℃冰箱，用于磷脂脂肪酸(PLFA)测定。风干土用于土壤酸碱度(pH)、全氮(TN)和土壤有机碳(SOC)测定。

1.3.2 土壤磷脂脂肪酸测定。将-20 ℃冰箱保存的土壤样品冷冻干燥，取冷冻干燥后的样品进行实验。以磷酸为缓冲液，按照氯仿-甲醇单相萃取的方法提取磷脂脂肪酸(PLFA)，然后用硅胶柱进行纯化、甲酯化，收集PLFA。将提取完毕的PLFA溶解于正己烷中，放在气相色谱上进行测定。利用MIDI软件(“Sherlock Microbial Identification System”，MIDI Inc.，Newark，DE，USA)测定PLFA的峰。参照PLFA生物标识物的数据库，对微生物群落组成进行分析[17]：革兰氏阳性菌(14:0iso、15:0iso、15:0anteiso、16:0iso、17:0iso和17:0anteiso)、革兰氏阴性菌(16:1ω7c、17:1ω8c、18:1ω5c、18:1ω7c、17:0cyclo和19:0cyclo)、丛枝菌根真菌(16:1ω5c)、腐生真菌(18:1ω9c、18:2ω6c)和放线菌(16:0 10methyl、17:1ω7c 10methyl和18:0 10methyl)。

1.3.3 土壤微生物熵和土壤酶活性测定。总磷脂脂肪酸生物量与土壤有机碳的比值(PLFA biomass/SOC)表征土壤微生物熵。土壤酶活性采用微孔板荧光法，以0.1 mol·L-1三水合乙酸钠为缓冲溶液，β-葡萄糖苷酶(βG)、纤维二糖酶(CB)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)以4-甲基伞形酮(MUB)为标液，亮氨酸氨基肽酶(LAP)以7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)为标液，过氧化氢酶(PER)、多酚氧化酶(PPO)以二羟苯丙胺酸(DOPA)为标液，酶标仪分光光度法测定酶活性[18]。

1.4 数据分析

用Excel 2019和SPSS 20.0进行数据处理和统计分析，对数据的正态性和方差齐性进行检验，剔除特异性的数据。采用双因素方差分析土层、耕作处理及两者的交互作用，单个土层不同处理间采用单因素方差分析，运用多重比较(LSD)检验其显著性(P<0.05)。应用Canoco 5.0软件进行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。

2 结果与分析

2.1 不同耕作模式对土壤理化性质的影响

土壤理化性质对不同土层、不同耕作处理的响应不同(表1)。土壤有机碳(SOC)和全氮(TN)在不同土层、耕作处理及两者的交互作用间差异显著(P<0.001)。随着土层的加深SOC和TN的含量显著降低，表层0～5 cm最高，10～20 cm最低。0～5 cm土层NT-100处理的SOC和TN含量显著高于CT和NT-0处理，5～10 cm土层NT-100处理的SOC含量显著高于NT-0。10～20 cm土层各处理间的SOC和TN含量变化不大。土壤碳氮比只在不同土层间差异显著(P<0.01)。0～5 cm土层碳氮比值显著高于5～10 cm和10～20 cm土层。

土壤水溶性碳氮(DOC和DON)含量在不同土层间的差异达到显著水平(P<0.01)，同时，DOC对耕作处理响应显著，而DON对两者的交互作用响应显著(P<0.05)。0～5 cm土层DOC和DON含量显著高于5～10 cm和10～20 cm。0～5 cm土层免耕(NT-100和NT-0)处理的DOC含量相较于传统耕作(CT)显著增加了27.8%和25.4%(P<0.01)，而DON含量在0～5 cm土层各耕作处理间变化不显著；5～10 cm和10～20 cm土层CT和NT-0处理的DON含量显著高于NT-100处理(P<0.01)。

表1 不同耕作模式下土壤理化指标Table 1 Soil physical and chemical indexes under different tillages

土壤酸碱度(pH)在不同土层间差异显著(P<0.05)，随土层加深pH值逐渐升高，10～20 cm土层显著高于0～5 cm和5～10 cm土层。土壤含水量在不同土层和耕作处理间差异显著(P<0.01)。10～20 cm土壤含水量显著高于0～5和5～10 cm土层；NT-100处理土壤含水量显著高于CT和NT-0处理，增加了12.6%和10.5%(表1)。

2.2 不同耕作模式对土壤微生物群落的影响

土壤微生物由细菌、真菌和放线菌组成，各类群磷脂脂肪酸生物量占总磷脂脂肪酸(TPLFA)的73.5%、9.7%和16.6%。其中，细菌可分为革兰氏阳性菌和阴性菌，真菌可分为腐生真菌和丛枝菌根真菌。总磷脂脂肪酸(TPLFA)、细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性菌(G+)、革兰氏阴性菌(G-)、腐生真菌(SF)和丛枝菌根真菌(AMF)(图1)对不同土层、耕作处理及两者的交互作用差异均显著(P<0.05)。土壤微生物生物量及各类群生物量具有相同的变化趋势，都随土层加深而降低，0～5 cm土层生物量显著高于5～10 cm和10～20 cm土层，且都表现为在0～5 cm土层NT-100处理显著高于CT和NT-0处理，除了AMF之外，5～10 cm和10～20 cm土层各耕作处理间差异不显著。AMF在5～10 cm土层CT处理的生物量显著高于NT-100，而10～20 cm土层CT处理的生物量显著高于免耕处理(NT-0和NT-100)。

注：CT，传统耕作；NT-0，免耕+无秸秆还田；NT-100，免耕+全量秸秆还田。对土层(L)和耕作处理(T)及两者的交互作用(L×T)进行双因素方差分析，数值P<0.05时代表差异显著。小写字母代表同一土层不同耕作处理单因素方差分析结果，不同字母代表差异显著(P<0.05)。下同。Note:CT,Conventional tillage; NT-0,No-tillage without stover; NT-100,No-tillage with total stover.The soil layers (L),tillage treatments (T) and their interaction (L×T) were analyzed by two-factor variance analysis,the P value <0.05 represent significant differences.Lowercase letters represent One-factor variance analysis results of different tillage treatments in the same soil layer,with different letters indicate significant differences at P<0.05.The same is as below.图1 不同耕作模式下土壤磷脂脂肪酸含量Fig.1 Soil microbial biomass of phospholipid fatty acids under different tillages

土壤微生物多样性(H′)(表2)在不同土层及土层和耕作处理的交互作用间差异显著(P<0.05)，10～20 cm土层H′显著高于0～5 cm和5～10 cm土层。在0～5 cm土层NT-100处理的H′显著低于CT处理，5～10 cm和10～20 cm各耕作处理间变化不显著。

土壤微生物真细菌比值(表2)在不同土层间差异显著(P<0.001)，随土层加深而降低，0～5 cm土层的真细菌比值显著高于5～10 cm和10～20 cm土层。代表土壤细菌结构的G+/G-在不同耕作处理和土层间没有显著差异。代表土壤真菌结构的AMF/SF在不同土层及土层和耕作处理的交互作用间差异显著(P<0.001)，5～10 cm土层AMF/SF显著高于0～5 cm和10～20 cm土层(5～10 cm>10～20 cm>0～5 cm)。在0～5 cm土层NT-100处理的AMF/SF显著高于CT和NT-0处理，在5～10 cm土层NT-100处理显著低于CT，而10～20 cm土层NT-100处理显著低于CT和NT-0。

表2 不同耕作模式下土壤微生物群落多样性及结构变化Table 2 Changes of soil microbial community diversity and structure under different tillages

土壤微生物群落的主成分分析表明(图2)，PCA 1和PCA 2轴分别解释了不同耕作模式下36.5%和17.7%微生物群落结构的变异。0～5 cm土层(绿色)与5～10 cm(橙色)和10～20 cm土层(紫色)在PCA1轴上显著区分开来，表明土层对微生物群落结构影响较大，而不同耕作处理在图上分异不明显。由PCA图可以看出，影响0～5 cm表层的主要特征脂肪酸为革兰氏阴性菌(cy17:0ω7c,16:1ω7c,18:1ω7c)、腐生真菌(18:2ω6c,18:1ω9c)和丛枝菌根真菌(16:1ω5c)。

注：基于所有鉴定的单独磷脂脂肪酸：相对丰度>0.5% 以及碳原子数<24。CT，传统耕作；NT-0，免耕+无秸秆还田；NT-100，免耕+全量秸秆还田，不同图形代表不同耕作处理，不同颜色代表不同的土壤层次。Note: Using all identified phospholipid fatty acids (PLFA) at >0.5% and C atoms numbers <24.Different symbols represent different tillage treatments.CT,Conventional tillage; NT-0,No-tillage without stover; NT-100,No-tillage with total stover,and different colors represent different soil layers.图2 不同耕作模式下土壤微生物群落结构的主成分分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of soil microbial community structure under different tillages

2.3 不同耕作模式对土壤酶活性的影响

与碳转化相关的β-葡萄糖苷酶(βG)和纤维二糖酶(CB)活性在不同土层、耕作处理及两者的交互作用间均差异显著(图3a和b，P<0.05)。0～5 cm土层的βG和CB活性显著高于5～10 cm和10～20 cm土层。在0～5 cm土层，NT-100处理碳转化酶活性最高：其βG活性显著高于CT和NT-0处理，CB活性显著高于CT处理；在5～10 cm两种酶在各耕作处理间的变化不显著；在10～20 cm土层NT-100处理的CB活性显著高于CT和NT-0处理。

与氮转化相关的亮氨酸氨基肽酶(LAP)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性在不同土层间差异显著(图3c和d，P<0.05)，同时NAG活性还受土层与耕作处理的交互作用影响(P<0.01)。10～20 cm土层的LAP活性显著高于0～5 cm和5～10 cm土层，而NAG则表现出相反趋势。NAG在0～5 cm土层，免耕处理其活性(NT-0和NT-100)显著高于CT，而在5～10 cm土层，NT-100其活性却显著低于CT和NT-0，10～20 cm土层各耕作处理间变化不显著。

多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(PER)活性在不同土层间差异显著(图3e和f，P<0.001)，5～10 cm土层的PPO和PER活性显著高于0～5 cm和10～20 cm土层。同时PER活性还受土层与耕作处理的交互作用影响(P<0.05)，在0～5 cm土层，NT-100处理的PER活性显著高于CT和NT-0处理，而5～10 cm和10～20 cm各耕作处理间变化不显著。

注：大写字母代表不同土层的单因素方差分析结果。Note:Capital letters represent one-factor variance analysis results of different soil layers.图3 不同耕作模式下土壤酶活性Fig.3 Soil enzyme activities under different tillages

2.4 微生物群落与土壤因子及酶活性的冗余分析

图4 土壤微生物群落与土壤因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) between soil microbial community and soil factors

表3 土壤微生物群落与土壤因子冗余分析结果Table 3 Redundancy analysis results of soil microbial community and soil factors

2.5 不同耕作模式对土壤微生物熵的影响

由磷脂脂肪酸生物量/土壤有机碳代表的土壤微生物熵(图5)在不同土层、耕作处理及两者的交互作用间差异显著(P<0.05)。0～5 cm土层的微生物熵显著高于5～10 cm和10～20 cm土层。0～5 cm土层NT-100处理的微生物熵显著高于NT-0，而与CT处理差异不显著。5～10 cm和10～20 cm土层各耕作处理间没有显著差异。

注：小写字母代表同一土层不同耕作处理单因素方差分析结果，不同字母代表差异显著(P<0.05)。Note: Lowercase letters represent one-factor variance analysis results of different tillage treatments in the same soil layer,with different letters indicate significant differences at P<0.05.图5 不同耕作模式下土壤微生物熵(磷脂脂肪酸生物量/土壤有机碳)的变化Fig.5 Changes of soil microbial quotient represented by PLFA biomass/SOC under different tillages

3 讨 论

3.1 不同耕作模式对土壤碳氮的影响

3.2 不同耕作模式对土壤微生物群落结构的影响

3.3 不同耕作模式对土壤酶活性的影响

土壤的生物化学反应少不了土壤酶的参与，其活性代表着土壤生化过程的强弱，影响着土壤生态系统的代谢[30]。免耕秸秆还田显著增加了表层土壤有机碳、全氮、水溶性碳含量，使土壤表层与碳氮转化相关的酶活性显著提高。0～5 cm土层NT-100处理碳转化相关的β-葡萄糖苷酶(βG)和纤维二糖酶(CB)、氮转化相关的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性均显著高于CT处理。冗余分析结果也表明，0～5 cm土层NT-100处理下碳氮酶活性与细菌和丛枝菌根真菌呈正相关关系，免耕秸秆还田使表层微生物数量显著增加，使其分解转化所需的酶相应增多[31]。0～5 cm土层NT-100处理过氧化氢酶(PER)活性增加主要是由于表层微生物数量增多的同时其呼吸所产生的过氧化氢增加，进而避免过氧化氢对微生物毒害作用的PER酶活性增加[32]。免耕条件下土壤微生物功能的提升，与土壤所能提供的生存环境和碳氮等营养元素有很大关联，添加秸秆后不仅使碳氮等含量显著增加，也对土壤表层形成一种保护，使其受环境因素(风、水等)的影响减小，有利于微生物活性的提高[33]。亮氨酸氨基肽酶(LAP)其活性与β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)具有相反的趋势，Li等[34]通过对两种酶的分析发现，当土壤中可被直接利用的氮源较低时LAP酶活性就会降低。秸秆中的氮源需被微生物分解转化，速效氮易随水分向下层转移，使下层LAP酶活性高于表层。土壤多酚氧化酶(PPO)在5～10 cm的活性显著高于其余两土层，这是由于高温和缺氧都会使PPO活性降低[35]，而5～10 cm土层温度比表层低，氧气含量比下层高，适宜PPO酶的生存。免耕+全量秸秆还田(NT-100)处理增加了表层土壤碳氮含量和土壤微生物生物量，促使与微生物群落代谢相关的酶活性显著升高。

3.4 不同耕作模式对土壤有机质稳定性的影响

土壤微生物熵代表着微生物对SOC的利用效率，数值越高微生物对土壤有机碳的利用效率越高。从微生物熵的分析来看，表层0～5 cm有外源有机物质输入的NT-100微生物熵最大，表明其土壤中有更多易于微生物利用的碳源[36]。NT-100碳氮转化相关的酶活性最高也证实了这一情况，微生物对外源有机质的分解大于对土壤原有有机质的分解，最终增加了土壤碳氮总含量；NT-0处理的微生物对SOC的分解能力低于CT，但统计没有达到显著水平。表明在没有外源物质输入的条件下，CT和NT-0两种处理分解的都是土壤本身的有机碳，这说明NT-0处理可以通过减少翻耕，降低微生物对SOC的分解速率从而增加土壤有机碳含量。范如芹等[37]和王淑兰等[21]研究也证实了免耕通过减少对土壤的扰动来降低土壤有机碳的矿化速率使土壤有机质含量增加。研究表明，与传统耕作相比，长期免耕无秸秆还田处理可以增加土壤有机质的含量及稳定性，而当免耕系统中进行秸秆还田处理可以显著增加土壤的微生物量及其活性，进而促进土壤有机碳的周转和积累。

4 结 论

免耕+全量秸秆还田处理对比传统耕作和免耕+无秸秆还田处理增加了0～5 cm土层土壤养分含量、微生物生物量及细菌、真菌、放线菌等类群微生物数量和碳氮相关的酶活性，促进土壤微生物对土壤有机质的分解利用，增加土壤有机质的稳定性，是提升东北地区黑土有机质含量和土壤微生物数量的一种有效的农田管理模式。