连续深松对黑土区玉米根际土壤细菌群落结构的影响

杨彦明,周 祎,张博文,张兴隆,刘景辉,3,郑海春

(1.内蒙古农业大学 农学院,内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古土壤肥料和节水农业工作站,内蒙古呼和浩特 010019； 3.全国农业科研杰出人才及其创新团队,内蒙古 呼和浩特 010010)

0 引 言

东北黑土区是我国粮食主产区之一[1]。黑土属不可再生资源，由于自然、人为因素导致黑土耕层变薄、犁底层上移、土壤硬化、肥力下降，严重制约黑土可持续生产能力[2-4]。土壤微生物参与土壤中氧化、固氮、硫化等生化过程，促进土壤有机质分解及养分循环，其多样性是评价土壤质量的重要依据之一[5-8]。旋耕、翻耕等措施均可影响土壤结构，进而影响土壤微生物丰富度和多样性，调节土壤生态功能。相关研究表明，深松改变土壤结构，改善微生物的生存环境，显著提高土壤微生物遗传多样性，并影响微生物功能多样性。土壤是微生物的主要生存空间，深松改善土壤孔隙结构及其理化性质，如孔隙大小、养分的有效性、氧气供给及水分等。微生物生存环境改变，导致群落丰富度及结构多样性的改变。土壤微生物群落构成、生物量及活动方式对土壤发育有关系密切，其主要参与土壤有机物质的矿化和腐殖质化过程，同时通过同化作用合成多糖和复杂有机物，影响土壤的结构和耕性。土壤微生物的代谢产物还能促进土壤中难溶性物质的溶解，参与土壤中各种物质的氧化-还原反应，促进植物营养元素的有效性[9-12]。

Badin[13]、Nunan等[14]、Ranjard等[15]研究表明，土壤各物理环境因子中，土壤温度、充气孔隙度、土壤容重对细菌群落结构影响较大，微生物群落结构与充气孔隙度相关性最高。刘淑梅等针对砂姜黑土开展不同耕作方式试验结果表明，相较于旋耕，深松处理微生物生物量氮显著降低37.9%，碳氮比增加138%[16]。而尹宝重等研究发现0～10 cm土层深松处理与旋耕处理微生物量差异不显著，除播种至返青期外，其余时期10～40 cm土层均低于旋耕[17]。戴亮研究表明，深松较旋耕翻耕显著提高0～10 cm土层土壤微生物量碳含量，但低于免耕[18]。Roger-Estrade等[19]研究认为，耕作措施对土壤团聚体造成的机械损伤使微生物更容易被捕食，进而改变其群落结构及多样性。传统耕作方式对土壤扰动大，使土壤微生物群落多样性和数量显著下降[20]。Andrade等[21]研究表明，随耕作强度的降低，土壤微生物群落丰富度和多样性增加。Zhang等[22]研究表明，免耕提高了0～10 cm土层细菌比例。Carpenter-Boggs等[23]研究表明，免耕较翻耕可提高土壤微生物数量及活性。深松对土壤扰动较翻耕小，并可有效打破犁底层，降低土壤容重，调节土壤固液气三相比[24-25]，较免耕可避免土壤板结、表土富营养化、土传病虫害加重等问题[26-27]。李景[28]研究表明，深松覆盖较翻耕提高了土壤各粒级团聚体的细菌多样性，对>2 mm和0.25～1 mm粒级细菌多样性影响显著[29]。赵亚丽等[29]研究表明，深松处理细菌数量较翻耕提高40.1%。目前，耕作方式对土壤细菌群落影响的相关研究多集中于免耕、旋耕、翻耕，但不同深松年限、深度对黑土细菌群落影响的研究鲜见报道。本试验通过深松年限与深度结合，研究其对黑土玉米根际土壤细菌群落结构的影响机制，为黑土区构建最佳耕层结构提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2016～2018年在内蒙古扎赉特旗农业科技示范园区(46°52′58″N,122°32′9″E)进行。该地区属温带大陆性气候，年均气温5.0 ℃，年均降水量432.8 mm，年均日照时数2 855 h，无霜期126～154 d，玉米生育期内降雨及平均气温见图1。试验地土壤类型为黑土，pH=7.47，养分含量为总有机碳25.88 g·kg-1，全氮1.96 g·kg-1，全磷0.66 g·kg-1，全钾33.9 g·kg-1，碱解氮167 mg·kg-1，速效磷11.4 mg·kg-1，速效钾161 mg·kg-1。

图1 2016-2018年玉米生育期降雨及气温变化Fig.1 Rainfall and temperature during the maize growing season in 2016-2018

1.2 供试材料

玉米品种为恒育498，施用的化肥为尿素(含N量为46%)、磷酸二铵(含N量为18%，含P2O5量为46%)。

1.3 试验设计

以翻耕为对照，设不同深松深度和年限处理(表1)。小区面积10 m×13.2 m=132 m2，随机区组排列，重复3次。5月10日播种，播前深松，播种量37.5 kg·hm-2，行距65 cm，株距25 cm，保苗数60 000株·hm-2；尿素、磷酸二铵基施(施用量分别为150 kg·hm-2、225 kg·hm-2)；2016-2017年5月26日、7月13日各灌水1次，灌水量900 m3·hm-2，2018年不灌水；10月10日收获测产。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 土壤样品采集。于2017年、2018年玉米抽雄期(8月20日)，采用对角线法采集土样(0～20 cm土层)，每小区选取5点，每点选择5株生长相对一致个体(每小区共25株)，将根系挖出，抖下根系附着疏松土壤，用毛刷收集与根系紧密结合的土壤，混匀并过1 mm筛，后装入聚乙烯无菌袋中，冷藏保存，由北京百迈客生物科技有限公司进行土壤微生物DNA提取及测序。每小区再选取5点，使用土钻钻取0～20 cm土样，10个小区、3次重复共计取土30份，后送至内蒙古杂粮工程中心实验室用于土壤pH、EC等指标测定。

表1 各处理实施方案Table 1 The planning of experimental treatments

1.4.2 土壤理化性质分析。土壤水分采用铝盒烘干法测定[30]；土壤温度采用TZS-qutTCW土壤环境测定仪测定；土壤容重采用环刀法测定[30]；土壤三相比气象比(%)、土壤三相结构距离(STPSD)、广义土壤结构指数(GSSI)参照王恩姮等[31]研究提到的方法进行计算；土壤pH按照土水质量比1∶2.5，用酸度计测定(Ohaus Starter3100)[32]；土壤EC按照土水质量比1∶5，用电导率仪(Ohaus Starter3100c)测定[32]。

1.4.3 土壤微生物基因DNA的提取。使用PowerSoil®DNA Isolation Kit土壤DNA提取试剂盒(Mo Bio Laboratories)从土壤样本中提取微生物总DNA。DNA的质量通过260 nm/280 nm和260 nm/230 nm的比率进行评估。然后在-80 ℃下储存DNA。

1.4.4 DNA扩增及测序。用无菌水稀释样品至1 ng·μl-1，以稀释后的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR。使用正向引物(338F，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、反向引物(806R，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，结合适配序列和条形码序列扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区。通过Vahts TM DNA纯化第一步PCR产物。在40 μl反应中进行第二轮PCR，反应中含有20 μl 2×Phμsion HF MM、8 μl ddH2O、每种引物10 μm和第一步的10 μl PCR产物。PCR产物经磁珠纯化，用Quant-iTTMdsDNA HS试剂对所有的PCR产物进行定量。使用Illumina Hiseq 2500平台(2×250对末端)对纯化的汇集样本进行了细菌rRNA基因的高通量测序分析。

1.5 数据处理分析

将优化序列进行聚类，划分操作分类单元(OTU)，并根据OTU的序列组成得到其物种分类(以97%为划定阈值)，获得各样品在门、纲、目、科、属、种水平上的细菌群落组成，并使用Excel 2003绘制门、属水平物种分类柱形图；使用Mothur软件计算各样品的α多样性指数，统计各样品在97%相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon、Simpson指数及覆盖度；以OTUs丰富度对序列数作图，进行稀释分析，绘制稀释曲线；采用R的vegan软件包进行主坐标分析(PCoA)、RDA分析，其中主坐标分析(PCoA)根据样本OTUs组成之间weighted unifrac距离矩阵。方差分析使用SAS9.0软件实现。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落alpha多样性结果分析

由表2分析，各处理Shannon、Chao1、ACE指数均低于CK，同一深松深度下，随深松年限增加，各处理土壤细菌群落多样性及丰富度表现为深松2 年高于1年；土壤细菌群落多样性及丰富度QS3较QS2提高，而SS3较SS2降低土壤细菌多样性、提高丰富度；CS3土壤细菌多样性及丰富度均低于CS2。相同深松年限，深松1 年各处理以CS1表现最优，深松3年土壤细菌多样性及丰富度分别为QS3、SS3最高。连续深松可显著改变耕层结构，影响土壤固、液、气三相比，进而对土壤水、肥、气、热特性产生影响，导致土壤微生态环境改变。深松1年，超深松具有较好的长效性，效果持续时间长。连续深松2～3年时，浅松效果最佳。

表2 2018年土壤样品测序覆盖度及α多样性Table 2 Soil sample sequencing coverage and alpha diversity in 2018

2.2 土壤细菌群落组成及年际间群落结构差异

由图2发现，2018年，土壤微生物相对丰度均>1%的优势菌门依次为：变形菌门(Proteobacteria，40.9%～45.4%)、酸杆菌门(Acidobacteria，17.3%～21.5%)、放线菌门(Actinobacteria，7.97%～12.7%)、绿弯菌门(Chloroflexi，6.09%～9.36%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，6.78%～8.56%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，4.92%～7.17%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，1.73%～2.38%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae，1.66%～2.36%)。2018年各处理土壤细菌群落中，绿弯菌门、芽单胞菌门、疣微菌门及硝化螺旋菌门相对丰度较2017年提高，而拟杆菌门、厚壁菌门(Firmicutes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、蓝藻门(Cyanobacteria)则降低。

由图3可知，在属水平上，2018年相对丰富>1%菌属共8个，依次为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、RB41、溶杆菌属(Lysobacter)、硝化螺菌属(Nitrospira)、Bryobacter、交替赤杆菌属(Altererythrobacter)、H16、芽单胞菌属(Gemmatimonas)。2017年相对丰富>1%菌属共6个，依次为鞘氨醇单胞菌属、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、Blastocatella、溶杆菌属、节细菌属(Arthrobacter)、Phreatobacter。2017～2018年，各处理均以鞘氨醇单胞菌属相对丰度最高，且2018年各处理该菌属相对丰度较2017年提高10.3%～73.3%，以QS1各处理增幅最大。由此可见，连续多年浅松对上述优势菌属相对丰度影响最大。溶杆菌属、Acidibacter、Arenimonas、Blastocatella、CL500-29marinegroup、Flavisolibacter、Sphingobium、Terrimonas相对丰度在两年内均处于较高水平，可见，上述菌属在土壤环境中相对稳定。

2.3 不同深松方式根际土壤微生物群落的差异性

按照相对丰度>0.1%为标准划分划分优势菌群[33]，2018年门水平下，各处理放线菌门相对丰度较CK降低，SS3降幅最大(图2)。除QS3外，各深松处理变形菌门相对丰度较CK提高，以SS3表现最优。除CS2外，各处理较CK提高芽单胞菌门、降低硝化螺旋菌门相对丰富。除SS3外，各处理Latescibacteria相对丰度较CK降低，降幅0.24%～43.9%，以QS2降幅最大。QS3、SS3、CS3较CK可显著提高酸杆菌门、绿菌门相对丰度，达9.83%、30.3%。各连续深松处理较CK降低疣微菌门、螺旋体菌相对丰度，SS3、CS3较CK降幅最大，为12.7%、20.9%。较CK相比，超深松处理降低了装甲菌门相对丰度，而深松处理则提高了装甲菌门相对丰度。相同深松深度，年限增加，酸杆菌门相对丰度上升，放线菌门相对丰度下降。相同深松年限，深度增加，Latescibacteria相对丰度先升高后降低。

2018年各处理鞘氨醇单胞菌属、溶杆菌属、Arenimonas、Stenotrophobacter、Blastocatella相对丰度较CK有所提高，链霉菌属(Streptomyces)、伦茨氏菌属(Lentzea)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)相对丰度降低(图3)。相同深度，RB41相对丰度随深松年限增加逐渐提高，伦茨氏菌属、类诺卡氏菌属随深松年限增加逐渐降低，Chthoniobacter、Flavisolibacter、Blastocatella、中慢生根瘤菌属(Mesohizobium)相对丰度先升高后降低。相同年限，随深度增加，气微菌属(Aeromicrobium)相对丰度逐渐降低，RB41、Terrimonas相对丰度先升高后降低。

2.4 各处理细菌群落PCoA及PLS-DA分析

Anosim分析结果显示，深松各处理间细菌群落结构差异未达到显著水平(R=0.027，P=0.335)，表明深松处理后土壤细菌群落可在作物生育中期(深松90 d后)恢复稳定状态，各处理间趋于一致。通过PCoA分析(图4)，2018年各处理与2017年相比，各处理间距离减小，表明各处理组间差异减小，结合图1分析，2018年玉米生育期内降雨量较大，表明降雨量提高，深松处理间差异减少。根据PLS-DA分析(图5)，按照深松年限及深度分组，各组分在第二排序轴上可区分。按照深松深度分组，CK、深松25 cm各样本分布于第二排序轴负端，深松35 cm、45 cm各样本分布于第二排序轴正端，在第一排序轴上深松35 cm、45 cm各样本分别分布于正端、负端。按照深松年限分组，CK、深松2年各样本分布于第二排序轴负端，深松1年、3年各样本分布于第二排序轴正端，在第一排序轴上深松1年、3年各样本分别分布于负端、正端。按照深松年限分组中，CK与深松2年各处理相似性较高，按照深松深度分组各处理与CK间相似性低于按照深松年限分组，表明深松深度对土壤细菌群落结构影响大于深松年限。

注：剔除未分类、未培养菌属后，提取相对丰度>0.1%的前40名菌属制图。Note:Deleting unclassified and uncultured species,and extracting the top 40 drawing the genus with>0.1% of relative abundance.图3 2017-2018年各处理根际土壤细菌属水平群落组成Fig.3 Bacterial community composition at gunes rank in rhizosphere soil in 2017-2018

2.5 细菌群落多样性指数与土壤理化因子的关系

各处理土壤温度与Shannon、Ace、Chao1指数呈极显著(P<0.01)或显著正相关关系(P<0.05，表3)，与Simpson指数呈显著负相关关系(P<0.05)；各指数与土壤土壤含水量关系不显著，表明土壤细菌群落受土壤温度影响大于土壤含水量。土壤气象比例与Ace、Chao1指数呈显著负相关关系(P<0.05)。土壤EC与Simpson指数呈显著负相关关系，土壤EC可一定程度上代表土壤含盐量，试验地土壤含盐量适中，未造成胁迫，可能由于随着土壤含盐量增加，细菌可利用的养分增加，进而提高了细菌丰富度与多样性。

图4 基于weighted unifrac距离的土壤微生物群落的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis of microbial communities based on weighted unifrac distance

图5 2018年土壤微生物群落PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of microbial communities in 2018

表3 细菌群落多样性、丰富度与土壤性质的相关性Table 3 Correlations between bacterial community diversity and richness with soil factors

采用Mantel test分析土壤理化性质与细菌群落变化之间的关系(表4)，结果表明，8个土壤物理特性与细菌群落结构具有一定相关性，但差异未达到显著水平。通过RDA分析(图6)，两排序轴解释了细菌15.3%的变异，Tem、pH、GSSI对土壤细菌群落结构影响较大。变形菌门与Tem、STPSD、EC呈正相关关系，与GSSI、Gas呈负相关关系。酸杆菌门、装甲菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门与土壤GSSI、Wat、Bulk、Gas呈负相关关系。放线菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、绿弯菌门与土壤GSSI、Wat、Bulk、Gas呈正相关关系。芽单胞菌门与土壤pH呈正相关关系，与Tem、EC呈负相关关系。2018年降雨充沛，各处理土壤含水量高，对水分较为敏感的菌群群落趋于稳定，表明进一步提高土壤含水量对土壤细菌群落的影响较小。

表4 土壤理化性质与细菌群落结构的Mantel test分析Table 4 Mantel test of the correlations between soil properties and bacteria community structures in Mollisols

注：Water：土壤含水量；tem：土壤温度；bulk：土壤容重；gas：土壤气象比例；Pro：变形菌门；Aci：酸杆菌门；Act：放线菌门；Chlorof：绿弯菌门；Gem：芽单胞菌门；Bac：拟杆菌门；Ver：疣微菌门；Nit：硝化螺旋菌门.Note: Water: soil moisture; tem: Soil temperature; bulk: soil bulk density; gas: Soil meteorological ratio; Pro:Proteobacteria; Aci:Acidobacteria; Act:Actinobacteria; Chlorof:Chloroflexi; Gem:Gemmatimonadetes; Bac:Bacteroides; Ver:Verrucomicrobia; Nit:Nitrospirae.图6 2018年土壤微生物群落结构与土壤性质的RDA分析Fig.6 RDA analysis between bacterial community composition and soil properties in 2018

3 讨 论

3.1 环境因子对根际土壤细菌群落结构的影响

相关研究表明，深松可以改善微生物的生存环境，提高土壤微生物遗传多样性，Bending等[34]研究认为，气候因子和土壤类型等因素对土壤微生物群落结构影响大于耕作，气温及降雨等气候因子可显著影响作物根系的生长发育，进而对根际土壤微生物群落产生影响[35-36]。Bardgett等[37]研究表明，季节变化可通过土壤矿物氮、土壤含水量显著影响PLFA图谱。樊晓刚[38]研究表明，土壤温度对微生物群落影响最显著，其次为耕作方式和土壤含水量。本研究的环境因子中，土壤温度、充气孔隙度、土壤容重对细菌群落结构均产生影响，根据PCoA分析，2018年细菌群落丰富度及多样性与土壤温度呈显著正相关关系，与土壤含水量相关性不显著，与土壤三相比中气象比呈显著负相关关系。本研究还证实，土壤含水量的增加并未显著影响土壤细菌群落丰富度和多样性。

3.2 连续深松对土壤细菌群落Alpha多样性影响

本研究表明，各深松处理较翻耕降低了根际土壤细菌群落多样性及丰富度，这与李景[25]、赵亚丽等[26]研究结果不同，与Lienhard等[39]研究结果相同。本研究中SS1处理与对照的α多样性产生显著差异，其它处理差异不显著，表明连续深松、增加深度对土壤微生物群体总数影响较小。焦永吉等[40]研究表明烟草传统耕作方式下连作3年以下，土壤微生物的多样性和活性较高。传统耕作降低土壤黏粒含量、土壤含水量，有利于提高优势菌群的竞争力，进而提高提高细菌群落Shannon指数、降低Simpson指数[39]。Musyoki等[41]、Zhao等[42]研究表明，土壤微生物丰富度及多样性与土壤总有机碳、氮呈正相关关系，深松改善土壤环境的同时易造成土壤有机碳活化及分解，导致土壤有机碳、氮含量降低，土壤细菌可利用的养分来源逐渐减少，生理活动受到抑制。深松与翻耕相比，未翻转土层，而翻耕将20 cm以下肥沃土壤翻至表层，为土壤细菌提供更多营养物质。

3.3 连续深松对土壤细菌群落结构的影响

研究表明，无机氮含量、土壤C/N等因子对土壤细菌群落结构也具有较大影响[43-45]，土壤中的有机质与速效氮对细菌的丰富度和Shannon指数具有正相关效应，pH值与AMF的丰富度指数和Shannon指数呈负相关关系[46]。由RDA分析可知，本研究选取的环境因子可解释门水平各种群15.3%的方差变化，深松较CK可提高变形菌门相对丰度，变形菌门相对丰度与本研究涉及的指标体系相关关系不显著，其变化与土壤化学、生物学因子的相关关系仍需进一步明确。本研究结果表明芽单胞菌门与土壤含水量呈负相关，这与DeBruyn等[47]结果相同，深松促进水分下渗，降低耕层土壤含水量，进而提高芽单胞菌门相对丰度。放线菌门与土壤GSSI、土壤三相比气象比例呈正相关关系，各深松处理较CK可提高土壤GSSI、气象比例，但降低了两菌门相对丰度。大部分放线菌门为腐生细菌[48]，可能由于深松处理实施时间较早，土壤有机质含量较低，放线菌门菌群营养来源减少，相对丰度降低。溶杆菌属、Arenimonas、鞘氨醇单胞菌属均属于变形菌门，分别具有生防细菌、氢自养反硝化[49]、代谢芳香化合物的作用，各深松处理较翻耕可提高上述菌属相对丰度。链霉菌属可产生目前已知的90%的抗生素，类诺卡氏菌属内生于植物可产生铁载体，伦茨氏菌属[50]属嗜酸丝状放线菌，在真菌拮抗中起着重要作用，三菌属均属放线菌门，深松较翻耕降低三菌门相对丰度，且伦茨氏菌属、类诺卡氏菌属随深松年限增加进一步降低，对土壤有机物的降解，微生物资源的保护，铁代谢及对致病真菌的拮抗具有一定不利影响。Flavisolibacter、Blastocatella与土壤重金属离子代谢相关，中慢生根瘤菌属(Mesohizobium)属固氮细菌[51]，上述菌门相对丰度随深松年限提高先增加后降低，深松2年各处理相对丰度最高，有利于氮素固定。

4 结 论

不同深松方式在土壤湿润年份对根际土壤细菌群落影响低于干旱年份，且湿润年份，各深松处理较旋耕降低玉米根际土壤微生物群落丰富度和多样性。细菌群落丰富度及多样性与土壤温度呈显著正相关，但与土壤含水量相关性不显著，与土壤气象比例呈显著负相关。根际土壤细菌群落结构受土壤温度、pH、GSSI影响较大。深松较翻耕可提高变形菌门，芽单胞菌门相对丰度，降低放线菌门、硝化螺旋菌门相对丰度。深松较翻耕可提高溶杆菌属(Lysobacter)、Arenimonas、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)相对丰度，有利于提高生防、反硝化及代谢芳香化合物等生态功能，降低链霉菌属(Streptomyces)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、伦茨氏菌属(Lentzea)相对丰度，对土壤有机质降解、微生物资源的保护、铁代谢及对真菌的拮抗作用具有一定不利影响，且类诺卡氏菌属相对丰度随深松年限提高而降低，铁代谢较差的土壤不宜连续深松。中慢生根瘤菌属相对丰度随深松年限提高先增加后降低，合理制定深松年限有利于提高土壤固氮作用，促进土壤培肥。