论东北地区主栽杨树品种的SSR 分析及鉴定

王成刚

(辽宁省法库县自然资源与行政执法中心，辽宁 沈阳 104000）

通过对东北地区林木栽种情况的调研，发现杨树品种栽种居多，其主要原因来自杨树具有改善气候条件、净化空气以及降低噪声污染等功能作用，但在目前杨树品种鉴别过程中，对其进行SSR 分析及鉴定，能为杨树育种研究高效工作开展提供极大地便利，提升杨树品种鉴别能力，切实解决因市场中不断出现多种类杨树品种而引发的识种辩种难度大问题，维护苗木交易市场秩序，从根本上保障品种权人合法权益不受损害。本次研究结果可为辽宁省沈阳市法库县地区杨树品种保护及鉴定工作开展提供强有力支撑。

1.栽种杨树的作用

栽种杨树的作用具体表现在以下几个方面：

一是环境质量有效改善。杨树栽种区域周边环境温度调节、空气质量有着明显变化，大树冠且茂密是杨树外观基本特点，夏季时节，其茂密的树冠可将一部分太阳辐射进行吸收，在蒸腾与光合作用影响，使得辐射热量降低，即时温度升高也不会产生过热感受。北方地区通常选择杨树作为主要树种进行栽种，防暑降热效果十分明显，有效改善环境质量同时，也能为居民打造更加舒适和凉爽的城市环境。

二是空气得到有效净化。由于空气中含有大量粉尘、二氧化碳以及其他有害有毒气体等，栽种高大型杨树，并将其用于防护林，可将空气中多种类型有害有毒气体进行部分吸收，并会有大量氧气释放出来，进而起到有效净化空气的作用，提升大气环境质量。

三是预防疾病及减少噪音污染。杨树栽种区域，可将周边环境空气中微颗粒数量变少，细菌没有可依附的物体，进而使得空气中原有病菌含量下降，疾病得到有效预防和控制。加上杨树自身具备较强抗污染性，合理化栽种杨树有利于降低城市居民发生疾病的几率。另外，杨树可对周边产生的噪音进行吸收，起到对噪音强度进行减弱的作用，加上杨树树冠比较茂密，其降低污染影响愈加明显。

2.栽杨树品种SSR 分析及鉴定的必要性

在林木育种研究过程中，鉴定林木品种是其中最为重要的一项工作内容，形态学标记、细胞学标记、生化标记，也称之为同工酶法，是以往较常运用的鉴定方式，但在实际运用过程中，此鉴定方式具有一定局限性，无法通过同工酶与蛋白质电泳技术只能检测出数量相对较少的位点，受多态性水平限制，针对具有极近亲缘关系的林木品种进行鉴定，无法起到精准鉴别的作用。

站在分类学角度上分析，杨树被划分在杨柳科，在华北、西北、东北等地域较为辽阔地区广泛分布，目前杨树品类较为丰富，含有多个品种，也包含从国外引进的品种。在现代农业与林业经济发展中，杨树作为一种经济性木材，发挥着重要作用，所带来的经济效益十分可观，因杨树特殊性，也是工业领域生产中较为常用的材料，进而具备较强的用途适用性。随着市场需求不断变化，杨树新品种研究持续深入，虽然经济生产要求得到充分满足，但却给杨树品种鉴定工作提升了难度。若选择传统鉴定方式，在实际杨树品种鉴定过程中，其鉴定结果准确性较低，杨树品种难以精准且高效区分，在一定程度上加剧苗木交易不法行为，带给品种保护工作落实极大地阻碍，也会严重损害品种权人的合法权益。

基于此，加大针对行之有效鉴定方式研究非常必要，精准、快速区分杨树品种，如SSR 分子标记鉴定法，因具备操作便捷、多等位、高多态性等特点，在对多样性遗传资源、系统发育等方面进行探究时，运用SSR 分子标记鉴定法，不仅有着明显运用优势，也能进一步提升杨树品种鉴别与良种保护工作效率和质量。

3.东北地区主栽杨树品种如何开展SSR 分析及鉴定

本文选择辽宁省沈阳市法库县地区的杨树新品种、良种以及主要栽培品种作为试验研究对象，通过SSR 分析对各杨树品种的无性系进行研究和鉴定。

3.1 试验杨树品种选择

通过选取辽宁省沈阳市法库县地区主要栽种的杨树品种，选定40 个杨树品种进行试验，杨树品种均由当地林业科学研究机构单位提供。

3.2 试验方法

杨树品种DNA 提取与琼脂糖凝胶电泳检测：第一，需要确认杨树叶片新鲜程度，对应每个杨树品种进行3-4个叶片采集，并在塑封袋中完整存放，再放置实验室冰箱中，此时冰箱温度设置为零下20 度；第二，杨树基因组DNA 可选用现阶段行业内新型基因组DNA 提取试剂盒，有利于提升杨树基因组DNA 提取效率，样品规格为2μL，琼脂糖凝胶电泳的质量浓度设置为10g/L，将准备的样品放置其中并进行检验，委托地方生物科技单位帮助合成21 对SSR 引物。

琼脂糖凝胶电泳质量浓度设置为30g/L，将此时获得的PCR 产物放置其中并进行检测，确认是否有其他产物存在。

PCR 产物的电泳检测流程：

3.2.1 洁净玻璃板准备2 块，同等长梳子一只，厚度规格为1mm。

3.2.2 制备非变性聚丙烯酰胺凝胶留用，根据试验要求，质量浓度设置为80g/L。

3.2.3 试验人员先确认凝胶是否已经处于凝固状态，若未凝固，则需要继续等待，等待完全凝固后对扩增产物进行提取，规格为2-3μL 即可，并在规格为1μL 的上样缓冲液中加入，待完全混合均匀后在上样孔中点入，设置恒定电压为200v，移动指示剂中的二甲苯青，电泳停止70 分钟后，在前提配置好的染色液中放置聚丙烯酰胺凝胶(染色液由质量浓度为2g/L 的AgNO3、体积分数1%的冰乙酸等物质配置而成)，持续摇动20 分钟。

3.2.4 确认电泳示踪液完全消失后，将一定量的蒸馏水加入，每次清洗间隔15 秒，共计两次，间隔15 秒期间，沥水需要取出，再将现场配置的显影液加入其中，轻轻摇晃8 秒，待目的条带出现后，对各样品进行拍照记录。

3.3 数据处理

数据处理过程中共分为四个阶段：

3.3.1 建立矩阵图。为了保证电泳结果能够顺利转化为电子谱图，试验人员尽可能选择人工束带方式进行操作，待上一个环节完成后，结合电子图谱所显示的信息完成0/1 二位矩阵制作，多态性位点无条带标记为0，有条带标记为1。同时试验人员需要将等位基因矩阵图在表格软件中进行建立。多态性条带比率(RPP):RPP=a/b，a=多态性条带数、b=条带总数。

3.3.2 基因片段长度。纵坐标设置为DNA 分子标准物(DL2000)片段长度对数值；横坐标则是对应目的条带位移距离。用直尺等辅助工具对不同等位基因位移距离进行测量，最后各等位基因片段长度数值获得，相对准确性较高一些。

3.4 结果分析

3.4.1SSR 扩增结果及多态性。对照21 对SSR 引物序列信息，完成40 份样品基因组DNA 的PCR 产物扩增，经过若干程序操作，选用显示高扩增效率、好特异性、良好稳定性以及动态性较为丰富的18 对SSR 引物，制作供试材料的指纹图谱，分析各样品遗传关系。

40 个杨树品种基因组DNA 的PCR 扩增利用上述已经选定的18 对引物，并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶完成电泳分离操作，在此基础上相对应扩增条带直接获得。通过查阅本次试验数据记录，其中多态性条带获得总计100 条，每个引物平均扩增条带约为5.6条，表示100%多态性比率，扩增条带数量最多为引物PMGC_2030，扩增条带数量最少为引物PN1297275。

3.4.2 杨树杂交品种遗传相似性。格式处理上述统计好的40 个试验材料0/1 矩阵图，并借助相关软件进一步分析杨树杂交品种遗传相似性。通过观察40 个杨树品种遗传相似性系数变化，各项数据均将其遗传相似性较为准确的反应出来，如各品种间远近亲缘关系的呈现。

杂交亲缘本质上为同一种品系，说明遗传相似性概率较高，如通过小叶杨与黑杨进行杂交的子代，其遗传相似系数达到最高值0.88，可以充分说明，利用上述筛选好的18 对引物，再通过SSR 分子标记技术处理，所获得的对应分子指纹图谱之间相似性极高。当分析具有相同遗传背景的杨树品种样品时，利用SSR 指纹图谱不仅能够将其快速区分，其可辨识度也进一步提升。

3.4.3 试验样品遗传相似系数聚类分析。从40 个杨树品种聚类分析结果来看，对上述40 个试验样品遗传相似系数进行聚类分析时，发现将树种父母系为同一品类的杂交杨树品种划分在一起，如将父本为小叶杨、母本为欧洲黑杨的树种将其汇聚一类，并将达到0.74 遗传相似系数的树种再进行划分。聚类时，先聚类母本效应较强的杂交品种，再根据父本之间遗传不同性来构成差异性聚集状况。各项数据显示，属于同一种杂交品系的父母本，在聚类过程中，可在较大遗传相似系数位置划分一类，两个相同品种间的遗传相似系数也均达到0.73 数值水平，可将其聚为一个类别。此外，当某一个杨树品种的母本和另一个杨树品种的父本为同一个品种，相较于父母本属于不同的杂交品系的遗传相似性，前者更高一些。

3.5 试验结果

通过分析与总结上述各项试验数据信息，得知杨树品种的遗传相似系数和遗传背景有着极为密切的关联性。一般情况下，越相似的杨树品种遗传背景，其遗传相似系数数值更加接近。本次试验选择40 个杨树品种作为样品，其中以小叶杨或黑杨为父母本或者父本或母本的品种数量为34 个，属于小叶杨和黑杨的杂交子代品种数量为15 个，均体现出了较高的遗传相似性。在试验过程中也发现，以小叶杨与黑杨进行杂交得出的白城小黑杨，其遗传相似系数较低，通过深入研究得知，其品种父母本虽然属于同一品种，但以小叶杨或欧洲黑杨为亲本的品种，可能由于种源不同性等同性质因素干扰，促使分子水平上遗传相似系数表现出的数值较小。

针对植物分类、林木遗传育种等方面研究运用传统形态学进行鉴别，相对难度较低，但不适合进行普及推广，适用性较低。天然杂交这一现象在杨树栽种中较为常见，其人工杂交相对更加简易，若依靠外部形态对杨树品种进行鉴别，则会受到环境等因素影响，无法保证鉴别结果准确性，因此，通过应用SSR 分子标记技术，不仅能够弥补传统形态学鉴别方式潜在不足，也能为我国杨树品种深层次鉴定和良种保护工作高质量开展提供强有力技术支撑。

因此，辽宁省沈阳市法库县杨树栽种过程中，应结合实际情况，灵活利用SSR 分子标记技术开展杨树品种鉴别工作，一方面为良种保护工作提供方便，提升杨树栽种质量，改善本地区生态环境质量；另一方面为整个地区综合性绿化规划方案制定提供参考依据，选择符合本地区地质条件、环境条件特点的优质杨树品种，彻底解决辽宁省杨树死亡率高问题。

通过实地调研得知，法库县杨树纯林面积大，生长期间病虫害发生几率较高，杨扇舟蛾、杨毒蛾、舞毒蛾、天幕毛虫等均属于法库县杨树常见虫害，极大地威胁了杨树健康生长，其中杨树烂皮病、杨树溃疡病等病害也时常发生，对法库县杨树病虫害防治工作带来极大挑战。

导致法库县杨树死亡率高得因素还包括以下几个方面：一是，引种不当。从上述40 个杨树品种分析结果来看，其中部分杨树品种并不适合在法库县地区进行种植，在实际引种过程中，过于考虑杨树品种丰产性，并没有意识到地域跨度过大引种带来的负面影响，法库县冬季温度较低，其引进的杨树品种极易发生冻害问题；二是，选地不当，近些年来，法库县降雨量不断提升，低洼处大量积水无法及时排出，促使杨树被水涝灾害影响导致死亡；三是后期林木管理工作不到位，法库县地区温差急剧变化，则促使树干内部水分流动不正常，受反复冻结与融化因素干扰下，会造成杨树表皮开裂，伤口被病菌侵染，病菌侵染面积持续扩散，同时长势相对较弱的小杨树也极易被传染，导致大面积杨树死亡情况出现，极大地影响了法库县林业健康发展。由此说明，鉴定法库县主栽杨树品种工作重要性，明确杨树品种鉴定在保护良种，引进优质品种等方面产生的积极作用，有利于从根源上规避上述问题发生。

杨树具有生长快、环境适应性较强、木材产量高等优点，将其作为法库县主要栽种林木品种，有利于法库县林业产业化发展。基于此，可通过对法库县主栽杨树品种进行SSR 分析及鉴定，了解各品种特性，通过对比各杨树品种特点，筛选出最为优质的品种作为主要栽种品种，既能增强杨树抗病性，又能提高杨树纯林病虫害防治工作水平，加强杨树种植管理，促进杨树种植经济效益、社会效益、环保效益提升，从而为辽宁省沈阳市法库县林业持续健康发展提供基础保障。

4.结束语

综上所述，林业作为促进我国经济增长的重要产业，杨树木材交易为我国林业产业创造极高的经济效益，杨树品种在日益增长社会经济发展需求作用下越来越丰富，但也伴随着杨树品种辨种难度加大等问题出现，传统鉴定方式具有一定局限性，特别是亲缘关系较近树种鉴定，基于此，应用SSR 分子标记技术，发挥技术优势，高效率、高质量研究杨树品种遗传资源多样性、系统发育等问题。