L-色氨酸色谱分离树脂的筛选

哈志瑞，马文有，沈春娟，沈　泉，马吉银（.宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏银川750000；.法国诺华赛分离技术上海有限公司，上海00000）



L-色氨酸色谱分离树脂的筛选

哈志瑞1，马文有1，沈春娟2，沈泉2，马吉银1
（1.宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏银川750000；2.法国诺华赛分离技术上海有限公司，上海200000）

摘要：通过L-色氨酸料液的成分分析，选定YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四种树脂对色氨酸微滤清液进行色谱分离。树脂筛选结果显示：树脂YP-004对料液中色氨酸、无机盐、糖的分离度最大，分离效果最为显著。收集液分析结果表明：色谱处理后色氨酸占干基比重的90%以上，比处理前提高了近1倍左右。

关键词：L-色氨酸；色谱分离树脂；筛选

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，广泛存在于天然蛋白质中，是人和各种动物生长发育不可缺少的必需氨基酸之一［1］，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸。L-色氨酸除在营养代谢中起重要作用外，还广泛用于医药、食品、饲料等行业。和其他生物工程产品一样，L-色氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，分离纯化等下游工程的成本占相当的比例［2］。目前国内规模化生产L-色氨酸的企业主要采用三膜法+离交工艺提取色氨酸［3-7］，有的厂家仍使用传统的活性炭脱色工艺，此提取工艺最大的问题是产品收率低、废水排放量大、各项单耗高、设备一次性投资大，导致国内L-色氨酸的生产成本高、利润低。因此，采取有效措施提高L-色氨酸的收率是目前亟待解决的问题。

色谱分离技术通过混合物中各组分在色谱分离柱两相间不断进行着的分配过程实现分离，是目前最有效的混合物分离、分析方法［8］。众所周知，色谱分离技术已被广泛应用于实验室分析，随着色谱技术的不断进步和行业发展，使得大规模的色谱分离技术被广泛应用于石油化工、淀粉糖等产品的分离纯化。通过不断探索和工艺革新，色谱工艺已经具备节省树脂用量、节省再生剂和洗涤水用量、工艺灵活性高、操作简单、投资费用低等优点，正被更多的行业所关注［9］。

在不同产品的色谱分离工艺中，如何找到适合目标产物的分离树脂非常关键。根据传统离子交换工艺分离提取氨基酸工艺过程中树脂的筛选经验［10～16］，找到适合色氨酸的色谱分离树脂，使色氨酸与杂质达到最大的分离度，并且保证色氨酸高纯度和高收率是我们研究的重点。

本实验与法国诺华赛分离技术有限公司合作，从YP-001（利用各种组分在色谱柱中的迁移速率不同来实现分离的层析色谱）、YP-002（利用固定相的结合专一性来分离分子的层析色谱）、YP-003（利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的分配色谱）及YP-004（依据料液中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的离子交换色谱）等四种功能性色谱树脂入手，通过单柱色谱分离实验探索色谱分离工艺在L-色氨酸分离纯化中的可行性，期望寻求到适合色氨酸高效分离的色谱树脂。进而应用到工业生产中，达到缩短L-色氨酸分离纯化工艺路线，提高产品纯度及结晶收率，降低L-色氨酸提取成本的最终目的。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

2.5 cm×40 cm中压特制层析柱（上海五相仪器仪表有限公司），BSZ-30自动部分收集器（上海青浦沪西仪器厂），Agilent LC-1260 HPLC（安捷伦科技有限公司），Atago PAL-3糖度仪（ATAGO（爱拓）中国分公司），754紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），pH 6.00显色液，1%色氨酸标准液（天津科密欧化学试剂有限公司），YP-001树脂（江苏苏青水处理工程集团有限公司），YP-002树脂（漂莱特中国有限公司），YP-003、YP-004（陶氏化学公司）等。

1.2方法

1.2.1色氨酸发酵液的制备

色氨酸发酵液通过三级发酵获得，其工艺流程如下：冻管→斜面→一级摇瓶→二级种子罐→发酵罐发酵→色氨酸发酵液。

斜面培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉20 g/L。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉7.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，FeSO4·7H2O 75.6 mg/L。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉1 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，FeSO4·7H2O 75.6 mg/L。

发酵条件为：35℃，250～550 r/min，通风比为1～1.5 vvm，二级种子罐培养14 h左右，发酵罐培养32 h。

1.2.2色氨酸发酵液预处理

将色氨酸发酵液用截留分子量为150 kD的陶瓷膜进行除菌处理，陶瓷膜清液再经0.2 μm膜过滤并脱气处理后可进入色谱系统。

1.2.3色氨酸色谱分离树脂筛选

将树脂装入单柱中，定量注入10 mL色氨酸预处理液。然后用2 g/L的氨水作为洗脱剂，按0.625 mL/min的流速将树脂柱中的料液洗脱出来；按10 mL/管的收集量依次收集树脂柱的出料，直到洗脱结束为止。试验结束后，将收集到的样品，按编号依次检测电导率、还原糖、色氨酸浓度等参数。

1.2.4色氨酸浓度测定方法

HPLC法：高效液相色谱分离工作条件Agilent C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）为分离柱，检测波长：278 nm；柱温为：39℃；流动相：V（0.03%KH2PO4溶液）：V（甲醇）= 90：10；流动相流速：1 mL/min。

1.2.5还原糖浓度测定方法

利用Atago PAL-3糖度仪测定发酵液中的还原糖浓度。

1.2.6电导率测定方法

使用雷磁DDSJ-308A电导率仪进行电导率测定。

2　结果与分析

2.1进料数据分析

对色氨酸陶瓷膜清液进行指标分析，其中色氨酸浓度测定基于HPLC分析后的外标法所得。结果如图1，表1所示。

图1　进料L-色氨酸HPLC图谱

表1　进料L-色氨酸数据分析

通过进料分析，可以看出色氨酸陶瓷膜清液中其他杂质含量达60%，严重影响色氨酸的一次结晶率。这些杂质中糖、无机盐占较大比例。因此选用合适的色谱树脂将清液中的色氨酸与糖、无机盐等杂质分离开来，对提高产品收率将起到关键作用。

2.2各色谱树脂对L-色氨酸的分离效果

针对色氨酸的料液分析，选用YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四种有利于分离糖、盐的不同类型的色谱树脂对色氨酸微滤清液进行单柱分离试验，结果参见图2～5。由图2～5可以看出：在单柱色谱分离条件下，各色谱树脂对色氨酸清液中的主要杂质分离效果差异明显。YP-001分离效果最差，杂质和色氨酸不能得到有效分离，YP-002和YP-003可以将色氨酸和杂质进行部分分离，但会影响其收率。YP-004对色氨酸的分离效果最好，分离度最大。在连续的收集液中，无机盐和糖主要集中在0.3～0.5 BV时流出树脂柱，色氨酸集中到0.6～0.8 BV时流出树脂柱，完全可以实现杂质和色氨酸的有效分离。

图2　YP-001对色氨酸的分离效果

图3　YP-002对色氨酸的分离效果

图4　YP-003对色氨酸的分离效果

图5　YP-004对色氨酸的分离效果

2.3 YP-004色谱分离收集液分析

对YP-004色谱分离树脂进行连续5批次的色谱分离验证，其分离效果与图5显示的分离结果相一致（图6所示），可以看出其对色氨酸与其他杂质的分离度较大，重复性较好。对分离过程中0.6～0.8 BV时的收集液进行分析，结果如表2所示。由表2可知：使用色谱树脂YP-004对色氨酸微滤清液进行色谱分离，收集液中糖和盐得到了有效去除，色氨酸占干基比重近90%，比处理前提高了1倍。

图6　YP-004色谱树脂重复性验证

表2　YP-004色谱分离收集液分析

3　结论

通过对色氨酸陶瓷膜清液的检测分析和色谱树脂的筛选试验，发现色氨酸体系下无机盐和糖是影响色氨酸纯度的主要杂质，色谱树脂YP-004可以对其实现较好的分离，色谱收集液中色氨酸占干基比重比处理前提高了近1倍左右。

参考文献：

［1］蒋婕，陈福旺，孟秀娟，等. L-色氨酸的研究进展［J］.畜牧与兽医，2012（S1）：66-70.

［2］闻亚红，刘杰，黄建民.微生物发酵法生产L-色氨酸的研究进展［J］.科技风，2014（2）：10-11.

［3］苏毅.发酵法生产L-色氨酸工艺优化［D］.天津：天津科技大学，2013.

［4］梅丛笑. L-色氨酸提取工艺的研究［D］.天津：天津轻工业学院，2000.

［5］刘旭红，赖新生.膜技术在色氨酸提取工艺的应用［J］.发酵科技通讯，2010，39（1）：28-29.

［6］周廷保.膜技术在色氨酸提取工艺中的应用探讨［J］.生物技术世界，2014（2）：163-163.

［7］葛方昕. L-色氨酸提取工艺的研究［D］.天津：天津轻工业学院，1999.

［8］刘宗利，王乃强，王明珠，等.模拟移动床色谱分离技术在功能糖生产中的应用［J］.农产品加工（创新版），2012（3）：70-73.

［9］李兆星，蔡振国.浅述色谱分离树脂在生化产品纯化上的工业应用［J］.化学推进剂与高分子材料，2006，4（5）：61-63.

［10］刘菊湘，刘国栋，阎虎生，等.用低交换容量聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂柱色谱分离中性氨基酸［J］.高等学校化学学报，2001，22（12）：2100-2103.

［11］张保林，盛芬玲，陶祖贻.氨基酸与离子交换树脂相互作用的研究（Ⅱ）——高浓度下离子交换树脂超当量吸附氨基酸的机理［J］.高等学校化学学报，1992（6）：840-66.

［12］李爽，沈亚领，迟莉丽. L-谷氨酰胺在强碱性离子交换树脂上的稳定性［J］.氨基酸和生物资源，2000，22（4）：39-42.

［13］汤家芳，张一竹.氨基酸制备色谱—Dpsc离子交换树脂柱分离发酵L-缬氨酸［J］.氨基酸和生物资源，2005，27（3）：43-45.

［14］李欣，张宝珠，赵玉红，等.离子交换色谱法分离氨基酸实验方法的改进［J］.实验技术与管理，2014（6）：51-53.

［15］黄毅，袁小红.离子交换分离混合氨基酸实验方法的改进［J］.实验科学与技术，2013，11（4）：35-36.

［16］刘菊湘，刘国栋，阎虎生，等.用离子交换树脂脱除氨基酸与盐混合液中的盐［J］.离子交换与吸附，2000，16（6）：521-527.

（责任编辑：朱小惠）

Screening of chromatographic resin for L-tryptophan separation

HA Zhirui1；MA Wenyou1；SHEN Chunjuan2；SHEN Quan2；MA Jiyin1
（1. Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750000，China；2. Novasep Separation Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China）

Abstract：Based on the analysis of the components of L -tryptophan fermentation broth after micro-filtrate，four resins named YP-001，YP-002，YP-003 and YP-004 were selected for L-tryptophan separation. The results showed that YP-004 possessed the best separation performance for L-tryptophan，inorganic salt and sugar. The purity of tryptophan reached more than 90%after chromatographic separation，which was nearly 1 fold higher than that before chromatography.

Keywords：L-tryptophan；chromatographic separation resin；screening

作者简介：哈志瑞（1982—），男，宁夏银川人，工程师，硕士，研究方向为生物化工，E-mail：hazhirui8201@163.com.通信作者：马吉银高级工程师，E-mail：majiyin@eppen.com.cn.

基金项目：国家国际科技合作专项项目（2014DFA31280）

收稿日期：2016-03-11

中图分类号：TQ92

文献标志码：A

文章编号：1674-2214（2016）02-0106-04