接种量对螺旋霉素发酵生产的影响

张义馨，张杨平，周锦敏，邓　锋（福建和泉生物科技有限公司，福建南平354200）



接种量对螺旋霉素发酵生产的影响

张义馨，张杨平，周锦敏，邓锋
（福建和泉生物科技有限公司，福建南平354200）

摘要：在2 m3中试发酵罐上探讨不同接种量对生二素链霉菌螺旋霉素发酵单位和发酵周期的影响，以最优的接种量在60 m3发酵罐中进行产业化验证。结果表明：在2 m3发酵罐试验中接种量为16%（体积比）且发酵周期120 h时，发酵单位达到最高即4.72 g/L。在60 m3发酵罐上接种16%的二级种子液进行20批放大验证，平均发酵单位达4.85 g/L。

关键词：螺旋霉素；接种量；发酵单位；验证

螺旋霉素（spiramycin，SPM）是一种十六元环大环内酯类抗生素，对革兰氏阳性细菌具有较大的抑制作用。其生产方法是在液态培养基中接入生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens），发酵120～160 h获得螺旋霉素含量为4.0～4.3 g/L的发酵液，然后通过溶媒萃取进行分离纯化［1-2］。在实际生产中存在发酵单位低、发酵周期长和设备利用率低的缺点，导致生产成本高。本研究通过考察不同接种量对发酵单位和发酵周期的影响，达到提高发酵单位且缩短发酵周期的目的。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌种

生二素链霉菌（S.ambofaciens）由福建和泉生物科技公司提供。

1.1.2培养基组成［3-5］

一级和二级种子培养基：葡萄糖15 g/L，玉米浆18 g/L，氯化钠12 g/L，玉米蛋白粉8 g/L，硫酸铵2 g/L，泡敌2.5 g/L，碳酸钙8 g/L，黄豆饼粉18 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L。

发酵培养基：豆油13 g/L，玉米浆6 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，氯化钠10 g/L，磷酸氢二钾1.8 g/L，泡敌0.33 g/L，碳酸钙5 g/L，葡萄糖60 g/L，黄豆饼粉25 g/L，氯化铵5 g/L，磷酸二氢钾0.8 g/L。

1.1.3主要设备与仪器

2 m3不锈钢发酵罐、200 L不锈钢二级种子罐、30 L不锈钢一级种子罐、60 m3不锈钢发酵罐、5 m3不锈钢二级种子罐、120 L一级种子罐均为福建省轻安工程建设有限公司设备；实验室pH计（梅特勒FE20）；多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱ZY-300Ⅳ）；生化培养箱（上海跃进HH-B11.420BS）；摇床（常州高德）；离心机（湖南湘仪L600）；生物显微镜（上海光学XSP-2CA）；在线溶氧电极（梅特勒）。

1.2培养条件［6-7］

一级种子培养：1）培养条件（温度28℃，搅拌速度200 r/min，通风比1：0.8 vvm，罐压0.03 MPa）；2）移种条件（pH上升到6.2～6.3，菌丝浓度18%～20%，镜检呈密网状）。

二级种子培养：1）培养条件（温度28℃，搅拌速度180 r/min，通风比1：0.8 vvm，罐压0.03 MPa）；2）移种条件（pH下降至5.6～5.7，菌丝浓度18%～20%，镜检呈密网状）。

发酵通风比：0～5 h控制0.3 vvm，6～10 h控制0.45，11 h至pH回升至6.00控制0.55 vvm，当pH回升至6.15控制0.45 vvm，pH回升至6.25控制0.35 vvm。

罐压：0 MPa；温度：28℃，pH回升至6.0控制25℃；搅拌：0～5 h控制35 Hz，6～80 h控制50 Hz，100 h控制35 Hz，130 h停止搅拌；放罐：pH上升至6.4且氨基氮开始回升即可放罐。

1.3方法

1.3.1测定方法

生物效价测定采用杯碟法［8］，鉴定菌为藤黄八碟球菌；总糖含量测定采用菲林滴定法；菌丝浓度的测定方法：取10 mL种子液或发酵液，3 500 r/ min离心10 min测量上清液体积，计算得出菌丝浓度（%）=（10-上清液体积）/10×100%；显微镜倍数：16×100；溶氧电极校正：发酵0 h时校正溶氧至100%。

1.3.2实验方法

将达到移种条件的二级种子液接入2 m3中试发酵罐中，装料体积为1.2 m3，接种量梯度分别为12%、14%、16%、18%、20%（接种量%=二级种子液体积/0 h发酵液体积×100）。在发酵72 h之前每隔12 h取样，72 h之后每隔24 h取样离线测定菌浓、总糖及生物效价，整个发酵周期溶氧采用在线测定。考察不同接种量对微生物生长速度、发酵单位及发酵周期的影响，综合考虑发酵单位和发酵周期从而确定最佳的接种量。最后将最佳接种量应用于60 m3发酵罐中进行20批次产业化验证。

2　结果与讨论

2.1发酵过程理化指标的变化

溶氧是微生物代谢重要的指标之一，溶氧的变化直接或间接反应了菌体的生长速度和基质的消耗。从表1可以看出：接种量越大溶氧下降越快，并且达到最低溶氧的周期也短。

从整个发酵周期来看，最低溶氧在3.9%～6.3%之间，接种量为12%、14%、16%、18%、20%时达到最低溶氧周期分别为25、25、22、19和16 h，说明接种量越大微生物生长越快。

表1　发酵过程中溶氧的变化

葡萄糖、饴糖和豆油是生二素链霉菌的碳源，而葡萄糖和饴糖属于速效碳源，豆油属于迟效碳源。发酵前期总糖消耗的快慢直接反应了微生物生长的快慢，当速效碳源利用结束后，微生物利用迟效碳源进入次级代谢。因此可以通过测定前期发酵液中总糖的含量判断微生物的生长速度。由表2可以看出：在相同发酵周期的前提下，发酵前期接种量越大发酵液中的总糖含量越低；当接种量达到20%时，36 h的总糖质量浓度已经达到了5.3 g/L；而接种量为12%时同期的总糖质量浓度为12.5 g/L。

菌体浓度是抗生素发酵生产的一个重要指标，菌体浓度的数值越大说明发酵液中菌体含量越多。从表3可以看出：螺旋霉素发酵的最高菌体浓度可达到40%，接种量为12%、14%、16%、18%、20%时达到最高菌体浓度的周期分别为60、 48、36、24和24 h，说明接种量越大微生物的生长速度越快，缩短了微生物生长适应期，能在较短的时间里进入生长对数期。

表2　发酵过程中总糖质量浓度的变化

表3　发酵过程中菌体浓度的变化

2.2发酵过程中生物效价的变化

发酵水平和发酵周期直接影响到生产企业的生产成本。因此，在提高发酵水平的同时，应重视发酵周期。发酵周期越短，发酵罐的利用率就越高，企业的产能就越大。从表4可以看出：1）接种量越大起步效价越高，这与接种量越大微生物的生长速度越快有关。2）接种量为18%、20%时，120 h后生物效价不增长或有所下降。通过显微镜观察发现：在110 h时菌丝出现大量的“空泡”，这可能是因为由于接种量太大导致前期微生物“疯长”后期菌体提早老化，最后导致发酵至120 h后生物效价不增长甚至下降。3）接种量为16%时，120 h发酵单位达到4.72 g/L，144 h放罐时发酵单位为4.64 g/L。接种量过大或者过小，均会影响发酵单位和周期。过大会引起后期菌体提早老化，影响产物合成；过小会延长培养时间，降低发酵罐的使用率。因此，综合考虑发酵水平和周期，接种量为16%且周期为120 h时发酵单位达到最高即4.72 g/L。

表4　发酵过程中生物效价的变化

2.3 60 m3发酵罐产业化验证

将2 m3中试发酵罐的最佳接种量应用于60 m3罐中进行20批次产业化验证，由表5可以看出这20批的发酵单位比较稳定。最低发酵单位4.71 g/L，最高发酵单位5.12 g/L，平均发酵单位4.85 g/L。因此，通过优化接种量，可以认为接种量为16%且120 h左右放罐的发酵工艺产业化生产是可行的。

表5　60 m3罐发酵单位

3　结　论

本研究首先在2 m3中试发酵罐上考察不同接种量对发酵单位的影响，确定16%为最佳接种量，且发酵周期120 h时发酵单位最高达到4.72 g/L；其次，将中试的结果在60 m3发酵罐中进行20批产业化验证，其平均发酵单位为4.85 g/L。通过优化螺旋霉素发酵的接种量后，发酵单位比原来提高了8%且发酵周期缩短了20 h。

参考文献：

［1］王印.螺旋霉素的生产与研究探析［J］.现代农业科技，2010 （10）：36-38.

［2］王欣荣，刘淑奎，夏永，等.螺旋霉素发酵工艺的研究［J］.中国抗生素杂志，2002，27（12）：720-721.

［3］陈长华，肇玉朋，张志勇，等.螺旋霉素发酵培养基的改进［J］.中国抗生素杂志，1994，19（4）：271-274.

［4］孙新强，孟根水，金志华，等.豆油对螺旋霉素发酵的影响［J］.中国抗生素杂志，2002，27（9）：524-528.

［5］孙新强.螺旋霉素高产菌种选育及工艺优化［D］.杭州：浙江工业大学，2002.

［6］罗俊，高淑红，陈长华，等.甲基化试剂对螺旋霉素发酵的影响［J］.化学与生物工程，2011，28（5）：46-50.

［7］戴剑漉，李瑞芬，王以光，等.响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基［J］.沈阳药科大学学报，2010，27（6）：482-488.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）［M］.北京：化学工业出版社，2010.

（责任编辑：朱小惠）

The effects of inoculum volume on spiram ycin fermentation

ZHANG Yixing，ZHANG Yangpin，ZHOU Jinmin，DENG Feng
（Fujian Hequan Biological Technology Co.，Ltd.，Nanpin 354200，China）

Abstract：In this study，the effects of inoculum volume on spiramycin titer and fermentation period of Streptomyces ambofaciens were investigated in 2 m3pilot fermenters，and then industrial verification was carried out in 60 m3fermenters with optimized inoculum volume. The results showed that spiramycin titer reached 4.72 g/L with inoculum volume of 16%（V/V）after 120 h fermentation in 2 m3fermenters. Twenty batches of scale-up verifications were performed in 60 m3fermenters by inoculating 16%of seed broth and the average titer reached up to 4.85 g/L.

Keywords：spiramycin；inoculum volume；titer；verification

作者简介：张义馨（1974—），男，福建建阳人，高级技师，主要从事抗生素发酵生产管理，E-mail：171067554@qq.com.

收稿日期：2016-01-05

中图分类号：TQ92

文献标志码：A

文章编号：1674-2214（2016）02-0110-04