酶固定化及应用研究进展

薛建跃

（巢湖学院化学与材料科学系，安徽 巢湖 238000）

酶固定化及应用研究进展

薛建跃

（巢湖学院化学与材料科学系，安徽 巢湖 238000）

本文主要从酶生物催化剂固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶的研究进展情况，并从其在医药、食品、环保、能源等方面的新应用出发，综述了固定化酶在新领域中的应用，展望了酶固定化研究的发展前景，指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。

酶固定化；微波辅助固定化；交联酶聚集体；仿生固定化

传统的酶固定化技术虽在一定程度上可以增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，并且传统固定化过程中，生物催化剂酶催化活力通常损失严重，如何通过固定化获得合适的生物催化剂一直为化学家和生物学家所关注。[1-3]

在酶生物催化剂的固定化研究中，目前不断地有新的载体和技术引入，[4]如：无载体固定化、微波辅助的固定化、阳光照射辅助固定化等等，且固定化生物催化剂的应用也越来越广泛地应用于生物医药、环境保护、化学工业、食品工业、医疗领域等，本文将从酶生物催化剂固定化载体、固定化方法和技术及固定化酶的应用等几个方面出发，归纳和综述这些方面近年来的研究进展。

1 酶固定化过程中的新载体

1.1 介孔材料

自从1992年美国Mobile公司首次合成出了MCM-41系列介孔分子筛以来，[5]介孔材料在酶生物催化剂固定化方面的研究和应用日益受到人们的重视，[6]孔道的结构和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，[7-8]合适的孔道中酶固定化后其活力提高到游离酶的2倍，[9]且三维及大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输，从而能提高酶的固定化和催化效果。[10-11]

目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域，[12-13]因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大（图1），且酶的负载能快速完成，[14]负载量高达580mg/g。[15]王安明等人[11]通过运用微波辐射加快物质传输原理，将微波技术引入酶在介孔中的固定化过程，利用微波辐射进一步促进酶蛋白在孔道中传输，在介孔泡沫硅 （Mesocellular Silica Foams，MCFs）固定化木瓜蛋白酶的过程中，使得酶负载量达到984.1mg/g。该高负载的固定化酶的制备将有利于其在在工业中的推广和应用，高负载的固定化酶一方面能有利于提高生产效率及时间、空间的利用率，另一方面通过补充高负载量的固定化酶，无须延长批次反应的时间。[16]

图1 棒状SBA-15相对于传统SBA-15的超强酶固定化能力

1.2 纳米管

Tsang[17]等人利用高分辨率电子投射显微镜（HRTEM）清晰地观察到碳纳米管道中的酶蛋白，通过活力研究表明管道中的酶蛋白活性未见明显变化。Davis等人[18]将青霉素酰化酶固定化吸附固定化于碳纳米管中，发现纳米管的内表面与酶蛋白之间存在着强烈的作用，从而使得管内酶蛋白结构稳定且保留相当的催化活力。Jung等人[19]先是将多壁碳纳米管羧基功能化，再将葡萄糖氧化酶共价固定化于管道表面制成了石墨电极，循环伏安研究表明此电极能有效实现葡萄糖的氧化及电子的传递，从而可应用于酶生物燃料电池中。近年来，硅纳米管也不断地作为载体被引入酶固定化过程。肖清桂[20]等人利用针状Ca-CO3作模板，成功制备了硅纳米管，并将青霉素酰化酶固定化于其中，发现酶的相对活力达到97.2%，表明酶固定化于管道中后，催化活力基本未见下降，同时，酶的热稳定性、pH耐受性等性能也明显改善。

1.3 磁性载体

由于磁性粒子易于分离，其作为酶固定化载体一直受到人们的青睐。Dyal等[21]先是将磁性Fe2O3表面功能化，再将酶共价固定化于其表面，制得了磁性固定化酶，该固定化酶稳定性极佳，14天后其催化活力下降不到2%。Yu等人[22]等将胞苷酸合成酶定向共价固定化于磁性纳米粒子表面，并得到了高稳定的固定化酶，该法在操作过程中省去了冗长的蛋白质纯化过程。雷重礼等[23]通过PEI包埋修饰磁性颗粒，再将胶原酶共价固定化于其表面，发现随着磁性载体表面PEI层数的递增，固定化酶的稳定性越来越好。Kim等人[24]将酶蛋白与磁性纳米粒子共同组装进介孔材料的孔道中，再通过戊二醛将酶蛋白交联制得磁性介孔材料内的交联酶聚集体（Magnetite Crosslinked Enzyme Aggregates，M-CLEAs），该固定化催化剂在催化过程中表现出极佳的稳定性，且因具有磁性而能方便地实现固液分离。

1.4 尼龙材料及棉布

Teke等[25]精巧地将尼龙布载体引入酶的固定化过程中，首先是在紫外辐射下借助苯甲酮引发尼龙纤维膜的活化，再通过甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝，实现纤维膜的功能化，最后将脲酶共价连接于其表面，从而在催化过程中能很方便地实现固定化酶与产物的分离。

Isgrove等[26]利用戊二醛活化尼龙薄膜，然后再将酶共价固定化到膜表面，通过NaBH4处理不饱和的C=N双键，以进一步稳定连接到膜表面的酶，同时运用不同的连接臂，发现PEI最适于稳定酶蛋白。Ibrahim[27]等将淀粉酶、漆酶等固定到酯交联和Cu2+鳌合的棉布表面，并充分地研究了该固定化酶的抗菌活性，结果发现棉布表面的酶保持了较好的稳定性，使用10个批次后，抗菌活性未见下降。李凤艳[28]等首先制备了溶胶凝胶，再将棉布和木瓜蛋白酶沉浸于其中，通过凝胶化，使酶固定化于面部表面，成功地实现了酶的固定化，经过6个批次的使用后固定酶的活力就下降到初始状态的30%，工业中应用时该类固定化酶的稳定性还有待于进一步提高。

1.5 离子液体

Rumbau等人[29]将山葵过氧化物酶固定化于离子液体 （butyl-3-methylimidazolium bistrifluoromethanesulfonimide，1-丁基-3-甲基-咪唑-六氟二甲磺酸铵盐）中，在加入到反应体系中，催化合成导电的聚胺高分子物质，催化过程中离子液体既用作酶的担体，也用作催化介质，其与水相不能互溶而组成二相体系，酶很容易从反应体系中分离（图2）。Safavi等[30]将碳-离子液体复合电极沉浸与血红蛋白的溶液中，通过吸附方式将血红蛋白固定化于电极表面制得了酶电极，研究发现修饰电极的环状电压展现了半可逆的峰位，氧化和还原的峰位电势分别达到-150mV和-290mV，电极表面的血红蛋白对氧气、双氧水、亚硝酸盐等显示了很好的电催化活力。

图2 离子液体固定化酶催化合成聚苯胺及分离

2 酶固定化的新技术、新方法

2.1 微波辅助固定化

王安明等人[31]首次将智能可控微波技术引入到酶固定化过程，常规方法中至少需要15个小时，微波辐射下只需要140秒，大大缩短了固定化时间，且微波辐射下青霉素酰化酶的活力是游离酶的1.45倍。王安明等[11]还将可控微波辐射技术引入低温下介孔泡沫二氧化硅固定化木瓜蛋白酶的过程，发现微波辐射下载体的载酶量达到984.1mg/g，且酶负载量及固定化酶活力分别是常规方法的1.26倍和1.86倍，此固定化效果国内外文献中未见报道。

2.2 光化学固定化

Kumar和Nahar通过光照将山葵过氧化物酶和葡萄糖氧化酶成功地固定于纤维素膜表面，并研究了光照强度对酶固定化的影响，发现光照下酶的负载量是黑暗中的2.6倍，且发现日光照射下的固定化效果优于紫外（365nm）辐射下的酶固定化，这为酶及其他生物分子的固定化提供了一条新的途径，但是该固定化局限于天气条件，工程中的应用会受到很大限制。

2.3 纳米技术辅助下的固定化

2.3.1 金属纳米粒子诱导下的固定化

在金属纳米粒子辅助固定化酶的研究中，印度学者Mukhopadhyay等[32]首先在Na-Y沸石表面沉积金纳米粒子，并将该复合粒子作为载体固定化胃蛋白酶，发现金属纳米粒子大大增强了酶的催化活力，遗憾的是酶是吸附于载体表面，重复使用6个批次后，催化活力即下降到初始状态的1/3。沈树宝等人[33]曾采用“一步法”制备了功能化的SiO2纳米粒子，并在其表面通过氧化还原的方法沉积了银纳米粒子，再将木瓜蛋白酶共价连接于载体表面，其中，当载体的银负载量为0.68%时，酶活回收率最高，比未负载银的载体提高了188%，且重复使用中固定化酶保持了较好的操作稳定性，这可能是固定化和催化过程中银纳米粒子与酶蛋白或底物酪蛋白之间至少存在着三方面的作用：络合作用、静电作用、纳米效应。

2.3.2 单酶纳米粒子

Kim和Grate首先通过丙烯酰氯分别将嗜热蛋白酶与胰蛋白酶表面进行不饱和修饰，再通过与不饱和单体的共聚而制得蛋白酶纳米粒子，固定化后酶的催化效率虽然下降了50%，但是酶的稳定性得到了大幅提高。清华大学的阎明[34]等人采用类似的方法，制得了山葵过氧化物酶纳米粒子（图3），该单酶纳米粒子在高极性的有机溶剂中仍能保持很强的热稳定性，而游离酶此时几乎丧失了所有活性。

图3 单酶纳米溶胶的胶囊化

2.4 无载体固定化

2.4.1 交联酶晶体（CLECs）

交联酶晶体 （cross-linked enzyme crystals，CLECs）是指通过交联剂，如：戊二醛，将在水溶液中的酶晶体交联成一种稳定结构及性能的晶态物质，其既具有酶的高活性、高选择性、反应条件温和等特点，又具有固相催化剂的环境适应性强、易回收等优势，从而使其在有机合成中应有较广。[35]1964年，Quiocho和Richards[36]最早制备了交联酶晶体，当时是用来固定酶的构象以方便进行X射线研究，其后的时间里对它的开发应用并未引起人们足够的重视。

2.4.2 交联酶聚集体（CLEAs）

相对于CLECs，交联酶聚集体（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）的制备过程更加简单，无需结晶，对酶的纯度要求不如前者，制备过程简化很多，其活性和稳定性可与CLECs相媲美。在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性，再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成CLEAs[37-38]（图4）。van Pelt等[39]制备了氰水合酶的交联酶聚集体，虽然聚集体的酶活性只有溶液酶的21%，贮存稳定性及操作稳定性显著改善。Kaul等[40]运用睛水解酶制得了相应的酶聚集体，活力回收达到80%，且该聚集体相对于游离酶表现出了较好的热稳定性及立体选择性。如果该方法中能成功解决固定化酶的机械稳定性及高活力回收等问题，该法必将成为酶工程领域中最成功的固定化技术。

图4 有机溶剂中脂肪酶聚集体的简易制备程序

2.5 点击化学固定化

点击化学（Click chemistry）的概念是由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless在2001年提出的一种快速合成大量化合物的新方法，[41]为继组合化学之后又一给传统有机合成化学带来重大革新的合成技术，该技术目前也已被用于酶的固定化研究。Brennan等[42]首先对金纳米粒子进行修饰，再通过点击化学方法将酶共价连接于纳米粒子表面，并通过电泳和荧光测试手段表征了该酶-纳米粒子复合物，初步估计每个金纳米粒子表面附着了7个脂肪酶分子。

3 固定化酶的新应用

固定化酶的研究和应用不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为具有节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求，目前固定化酶已被广泛应用于医药领域、食品行业、化工行业、材料科学、环保领域、能源领域、蛋白质组学等领域。

3.1 医药领域

青霉素酰化酶，亦称青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，既可水解青霉素和扩环酸生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基脱乙酰头孢烷酸（7-ADCA），也能制备半合成抗生素类。

碱性条件下青霉素酰化酶催化水解可生成半合成β-内酰胺类抗生素所需中间体6-APA（如图4所示）、7-ADCA。酶法催化具有效率高、环保且易分离，可重复使用以降低成本的优势。用6-APA、7-ADCA等中间体，与新的D-氨基酸类在酸性条件下也可合成各种具有新的抗菌活性和抗菌谱的半合成抗生素。固定化酶的酶法合成具有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护等优势。目前报道过的酶法合成产品有阿莫西林[43]、头孢氨苄[44-45]、氨苄西林[46]等。

3.2 食品行业

Othman等[47]分别将脂肪酶固定于商业载体Eupergit C和Eupergit C 250L上，并将制得的固定化酶应用于合成薄荷醇丁酸酯，该化合物广泛运用于食品行业。[48]Del Nobile等[49]将柚苷酶固定于聚乙二醇膜表面，制得食品级的生物活性膜，用于柚汁的包装中以便在贮存过程中减少柚汁中柚苷的含量，从而大大提高柚汁的感官品质。

3.3 化工行业

随着绿色化学工业的不断发展，固定化酶生物催化剂在化工行业中的应用越来越深入，其主要作用是代替化学催化剂制备化工原料。Yu等人[50]将脂肪酶固定化于SBA-15介孔材料中，并利用该固定化酶拆分制备（S）-2-辛醇中，结果表明在优化的条件下（S）-2-辛醇ee%超过99%，且转化率超过52%，固定化酶重复使用5次后仍能保持90%的初始活力。

3.4 环境保护

Havens等[51]通过共聚方式将硝苯硫磷酯水解酶镶嵌于聚氨酯泡沫中，将其成功应用于有机磷农药的解毒和去除过程中。LeJeune等[52]运用类似的方法制得膦酸酯化酶泡沫酶，将此泡沫酶应用于空气净化中降解空气中的神经毒气，取得了一定的效果。张等人[53]将山葵过氧化物酶固定于聚丙烯酰胺凝胶中，再将制得的固定化酶填充于柱子中，用以去除水体中的五氯苯酚，1小时内能将五氯苯酚浓度从13.4mg/L降到4.9mg/L，且柱中的固定化酶能重复使用。

3.5 能源领域

Sagiroglu[54]将猪胰脂肪酶和假丝酵母脂肪酶分别固定于水滑石表面，并将它们用于催化葵花子油转脂化作用制得生物柴油，制得的蛇生物柴油燃烧后无SO2产生，且烟尘颗粒减小，研究还发现2种脂肪酶皆表现了很好的活力，同时转脂化过程中正己烷等有机溶剂比较适合酶催化反应。另外，如何提高电流密度一直是困扰酶生物燃料电池研究人员的难题，[55]而提高酶的负载量将是解决此问题的一条重要途径，同时，利用纳米结构固定化酶从而制得酶电极以稳定酶的催化性能也在酶生物燃料电池研究中扮演重要的角色。Fischback等[56]将葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）组装进碳纳米管（CNTs），并利用其构建酶阳极，采用可折叠式质子交换摸（PEM）燃料电池模式装配了微型生物燃料电池（BFCs），大小为12×12×9 mm，该酶生物燃料电池能连续使用16小时以上。

4 结论与展望

（1）制备高活性、高负载、高稳定的固定化酶是酶固定化研究的主要方向，因为这样的固定化酶在应用中能大大降低目标产物的制备成本，且在酶生物燃料电池中能大大提高电流密度，在蛋白质组学研究中能节省时间，提高效率和准确度。

（2）随着多酶催化的深入研究，多酶固定化技术的开发将成为酶固定化领域的重要内容之一。

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PROGRESS IN THE IMMOBILIZATION AND APPLICATION OF ENZYME BIOCATALYST

XUE Jian-yue
（Department of Chemistry and Materials，University of Chaohu，Chaohu Anhui 238000）

This article reviewed the new progress of the immobilization of enzyme biocatalyst from immobilization support，immobilizing technique.The new application of the novel immobilized enzyme in the pharmaceutical engineering，food engineering，environment engineering，energy engineering and proteomics was also represented.Trend of enzyme biocatalyst immobilization was proposed to be multi-enzyme immobilization and immobilization of enzyme with high loading，high activity and stability would be the research goal of the immobilization.

Enzyme Immobilization；Bioenergy；Cross-linked enzyme aggregates （CLEAs）；Bionic Immobilization

Q814.2

A

1672－2868（2010）06－0082－07

2010－08-06

安徽省教育厅自然科学基金项目（项目编号：KJ2009B230Z），巢湖学院科研启动项目

薛建跃（1963－），女，安徽无为人。副教授，研究方向：绿色化学与生物催化。

责任编辑：宏 彬