蛋白质结构解析技术研究现状与方向

徐颢溪刘 磊

（1.中国科学技术大学，安徽 合肥230026；2.安徽职业技术学院，安徽 合肥230011）

蛋白质是生物的生命进程中的主要功能性大分子物质，结构生物学即利用蛋白质分子空间结构的解析来分析蛋白质生物学功能，并进一步研究生物体生命活动分子机制[1]。故解析蛋白质分子结构是日前较为热门的研究方向。现阶段对蛋白质分子空间结构的解析方法主要有较为传统的核磁共振技术（nuclear magnetic resonance）、X射线晶体衍射法（Xray crystalline diffraction）以及近期研究较多的冷冻电镜技术（Cryo-Electron Microscopy）[2]等。

一、X射线晶体衍射法

自从1895年伦琴发现X射线后，物理学家们就开始探索X射线的特性及其应用方向[3]。在1934年，贝尔纳和克劳福特得到了第一张蛋白质（胃蛋白酶）晶体的X射线衍射图片。1953年，蛋白质晶体学家佩鲁茨通过将重金属粒子引入蛋白晶体里，进行同晶置换来解决蛋白晶体X射线衍射相位问题，提出了蛋白质晶体分子结构可测定型的理论基础，并进行了低分辨率的蛋白晶体衍射解构[4]。历史上，用X射线晶体衍射法第一个测定蛋白质大分子结构并对其分子结构进行解释的是布莱克和菲利普斯，他们分别测出了溶菌酶的三维空间结构并解释了其分子作用机理[5]。后期，X射线大多由同步辐射光源产生。

X射线衍射法测定蛋白质空间结构时，需要先对目标蛋白进行纯化及结晶。解析蛋白晶体结构所涉及的X射线波长约为1A˚，这是因为蛋白晶体结构中的分子均为规律性分布，且晶体内原子间的距离与此波长范围的数量级相同[6]。当光打到蛋白晶体上，蛋白晶体内每个原子都产生次生射线相互叠加且干涉，且形成强X射线衍射成像。其晶体衍射状况和晶体自身结构相关，具备强烈的规律性及特征性。其衍射强度与单位晶胞中的重金属原子排列周期及方式等特性相关，衍射的方向和单位晶胞的大小及形状等相关[7]。人们利用晶体中衍射位点的间距及排列分析蛋白晶体结构的排列规律及方式，并通过计算机辅助计算，利用衍射强度的不同，分析蛋白空间结构中单个原子的坐标位点[8]，以此解构蛋白晶体。

二、核磁共振技术

核磁共振包括固相和液相技术，其最大特点是液相核磁共振技术。固相核磁共振技术主要用于不可溶蛋白结构，而液相核磁共振技术的应用更为广阔，它可以在液相环境中，在各类如温度、离子浓度及pH值等因素接近生理条件情况下，对蛋白进行解构。1978年，核磁共振技术首次被用于蛋白质结构的解析，获得首个高分辨率病毒衣壳蛋白三维结构（西红柿丛矮病毒）[9]；在2008年，利用固体核磁共振技术辅助电子显微镜，科学家获得了β片层结构的淀粉样纤维蛋白的完整结构，此蛋白与阿尔茨海默病关联紧密，有助于人们对此病症分子机理及诊疗手段的研究[10]；核磁共振技术中取得重要进展领域之一是通过核磁共振技术无损获得细胞中分子结构信息，2009年，有研究显示,核磁共振技术展示了泛素在细胞内外质子交换速率之差，以及细胞中蛋白FKBP12与免疫抑制剂相互作用方式[11]，令人类社会进一步了解了分子及原子水平中生物大分子功能，以及蛋白质结构和功能的关系。

在应用液相核磁共振技术对蛋白结构进行研究的过程中，首先需要通过同位素对蛋白样品进行标记，主要是在培养基中利用15N对氮源标记、利用13C对碳源标记，用同位素标记的碳源或氮源为唯一碳素或氮素的来源。通过核磁共振技术处理后，需要指认核磁共振谱图上的化学位移，即得到蛋白结构中可形成核磁共振记号的每个原子化学位移的数值。包括主链上及侧链上每个原子的化学位移。化学位移指认可通过主链试验HNCA、HN（CO）CA等或侧链特殊实验（HB）CB（CGCD）HD等确认[12]。正确选择原始结构是后续步骤的重要基础，通过一些自动化软件，如CYANA中的CANDID软件包，或ARIA等[13]，确认NOE约束归属而获得粗糙的蛋白原始折叠空间构像。在此基础上，继续研究，获得其结构约束，进一步通过如ANSO、SANE、Xplor-NIH或CYANA等软件计算结构，结构确认后最后通过如AMBER、CHARMM以及INSIGHT等模拟分子动力学的软件进行蛋白结构的精修。

三、冷冻电镜技术

冷冻电镜技术，即冷冻电子显微镜技术[14]，通过将样品迅速冷冻固定于玻璃态不定型溶液里，用透射电镜在低温条件下显像，再通过图形处理及后期计算解析样品空间结构。此法具有样品无须结晶、可研究的生物分子跨度达到12个量级、所需样品量少、样品分辨率已至（近）原子水平等优点，突破了研究生物大分子的各类难题。近几年，冷冻电镜技术的长足发展一是来自硬件的更新——DDD（Direct electron detector，自接电子检测相机）的出现，DDD具备高分辨的成像装备，能直接检测电子[15]；二是来源于图形图像处理软件的进步，可分辨较低分子量的小分子蛋白和细胞器，并可对于样品漂浮而产生的偏差进行纠正。

冷冻电镜技术包括了样品分离纯化、电镜样品的制备、蛋白数据搜集及处理等步骤。冷冻电镜中所需样品纯度需为90%至95%以上，对于纯化较困难的蛋白样品，后期可进行软件数据模拟纯化以区别不同状态样品。制备电镜样品时，通过液氮冷却的乙烷将含水样品速冻，将水分子转为玻璃态非晶体冰，样品悬浮于其中，用于减少电子辐射，保持其天然构像[16]。然后通过电镜进行数据的收集，数据的收集量来源于被测蛋白样品的均一性、分辨率、对称性及成像质量等，对于均一性差、分辨率差以及不对称分子通常需要采集大量粒子数据，约收集5到15万个数据才可达到近原子分辨率。粒子数据收集后需要进行进一步的处理，首先要先确定粒子的参数，每个粒子图需确定5类参数，分别为平移的自由度X和Y（两个平面中）、旋转的自由度α及β（两个离开平面中）和γ（一个平面中）[17]，其中从旋转的自由度获得了粒子空间三维数据，利用对位可消除一个平面中的自由度，可通过重构软件SPIDER、XMIPP及EMAN2等的计算用以确认每个粒子相关参数。然后，根据K均值聚类等算法进行二维分类，用以估算粒子分布及取向、粒子数据质量等，二维分类后通过中心截面原理利用共价线、RCT等方法重构样品的空间三维结构，而后进行三维分类和模型的精修。三维分类可确认不同粒子的空间取向、空间构像及组成和结构等，而获取高分辨率空间结构，常用FREALIGN和RELION软件[18]。对模型进行精修时，可利用投影匹配的方法进行比对，最终大幅度提高物质空间结构的分辨率。最后通过FSC曲线对分子结构的分辨率进行评估，通常分辨率在15A˚以上，可分辨蛋白亚基的分界线；分辨率在10A˚以上可辨认二级结构密度；分辨率在4A˚以上可分辨蛋白主链；当分辨率在3A˚左右，即可辨别氨基酸残基侧链基团等[19]。

四、未来方向发展

蛋白结构解析技术对于蛋白分子的结构、生物学功能及其生理特性的了解和应用具有重要的意义[20]。近年来，多种蛋白结构解析技术的并行发展，同样对结构生物学的发展发挥了重要的作用。

X射线晶体衍射法较为主流和经典，2009年世界上第一台X射线自由电子激光装置建成[21]，自由电子激光形成的射线是具备短时间高强度的脉冲，对不能结晶的蛋白结构、超小晶体以及受损晶体可获得衍射成像，使人们对生物大分子结构通过X射线衍射法的解析方式有了另一种不同且全新的理解，在RCSB Protein Data Bank中通过X射线晶体衍射法解析的蛋白结构占比约88%。但依赖于大分子晶体的制备，对于许多无法结晶的物质存在着结构的难度。利用同步辐射光源解析的主要是静态或者微动态蛋白晶体结构，利用X射线自由电子激光解析的则是ps甚至fs量级的蛋白动态空间构型[22]，被认为有可能为生物大分子解构方式带来大跨步的跃进。

核磁共振技术可获得蛋白的静态和动态结构，在20世纪末期，只有相对分子质量较小（＜25k）的蛋白空间结构可通过核磁共振技术解构[23]。后因核磁共振设备的不断更新，以及新的核磁脉冲和蛋白标定技术的发现，核磁共振技术以及可以解构的蛋白已远大于25k，甚至可解构超大蛋白，如分子量大小为几十万的蛋白空间结构。不光如此，液体核磁共振技术更大的优越性表现在可解构蛋白分子在溶液环境中的动态结构，它可利用核磁弛豫现象研究原子水平下的多位点的蛋白动力学性质。在生物体中，蛋白大多具备功能性，故静态空间结构的解构往往不能完全反映蛋白功能性，故蛋白动态结构的解析是对于蛋白生物学活性研究的关键一环。近些年核磁共振技术发展到可研究更高分子量的蛋白大分子的动态结构，如选择性标记或氘代样品制备[24]，可获得更多长程约束，提高解构质量，如TROSY（Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，横弛豫优化脉冲）的出现，可指认化学位移及解析解构[25]。但多测定的为分子量较小的大分子类物质，可解析的蛋白结构有限。故核磁共振技术，特别是液相技术可研究蛋白动态结构、功能及其动力学特性，有其独到之处，虽然如此，但由很多实验技术还不够成熟，不具备普适性，还需要继续分析和改进。

最近发展迅猛的冷冻电镜技术，可测定非晶体生物大分子类物资，通过冷冻电镜技术可利用其高分辨率能观察到小分子物质、解析小分子蛋白以及不对称样品等[26]。冷冻电镜对蛋白质结构解析技术的发展在医学领域做出重要贡献。20世纪末，因冷冻电镜对生物对称性样品特有的高度解析性，张景强得到了分辨率仅为0.8nm的家蚕质多角体病毒，在病毒蛋白结构研究及针对病毒致病机制对应药物研制方面功不可没[27]；清华大学研究团队在2016年第一次利用冷冻电镜获取了线粒体中呼吸链超级复合蛋白空间结构，指明了以其为靶向物质药物的研究方向[28]；中国科学院生物物理研究所李国红和朱平研究组合作获得了30nm染色质左手双螺旋高分辨率三维结构[29]，有助人类对癌症等病症分子机制研究，并为人类基因组计划做出了重要贡献。同时冷冻电镜技术伴随着人类社会对生命科学领域研究的重视而逐渐发展起来，清华大学王宏伟研究组于2017年首次提出且利用冷冻电镜成像理论新方法过焦成像技术得到高分辨蛋白质空间结构[30]。2018年浙江大学冷冻电镜中心首次解析了蛋白质原子分辨率结构[31]，2020年，德国马克斯普朗克生物物理化学研究所研究团队和英国剑桥大学研究团队利用冷冻电镜技术分别解析了至今为止最为清晰的原子级分辨率的蛋白质结构，并首次识别出蛋白分子中单个原子位置[32]。冷冻电镜技术及方法已逐渐成熟，迅猛发展，但对晶体类蛋白的应用场景却有所不足。

总之，各类蛋白解析技术有其优点，也有其缺点。在后续研究发展中，需将多种结构解析技术结合而有利于各类难以解构的蛋白之谜被解析，并进行更深层次的探讨及蛋白性质及功能的应用。