副猪嗜血杆菌的分离鉴定及血清型分析

钟敏，胡艳，苏州，钟云平，郭礼荣，邱光忠

（赣州市畜牧研究所，江西 赣州 341401）

副猪嗜血杆菌病（HPS）又称为纤维素性浆膜炎和关节炎，也称革拉瑟氏病。全世界均有发生。在猪无名高热病流行中，副猪嗜血杆菌病也是并发症之一。副猪嗜血杆菌是居于健康猪的上呼吸道的常在菌，在特定条件下可以侵入机体，主要危害2～4周龄的猪，通常见于5～8周龄，特别是断奶前后和保育仔猪多发，发病率10%～40%不等。HPS血清型复杂多样，按照KRG琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型。蔡旭旺等[1]研究表明我国以血清4型和5型最为流行，其次为13型，14型和12型。急性病例，往往首先发生于体况良好的猪，病猪发热（40.5℃～42℃）、精神沉郁、食欲废绝，呼吸困难，皮肤苍白，耳梢发紫，眼睑水肿，行走缓慢或不愿站立，腕关节、跗关节肿大，共济失调，临死前四肢呈划水样。有时也会无明显症状而突然死亡。慢性病例多见于保育猪，主要是食欲下降、咳嗽、呼吸困难，被毛粗乱，跛行，甚至衰竭死亡。感染母猪多出现关节肿胀、跛行、颤抖等亚临床症状。剖检可见纤维素性或浆液性浆膜炎、关节炎和脑膜炎[2]。

近年来，随着我国养猪业的规模化和集约化发展，动物福利水平相对落后，副猪嗜血杆菌病常作为继发性病原菌，在蓝耳病病毒、圆环病毒II型、伪狂犬病病毒及流感病毒等感染后继发感染，并呈逐年上升趋势，甚至与传染性胸膜炎放线杆菌、巴氏杆菌、链球菌等混合感染，使病情严重化，死亡率增加，引起众多猪场的高度重视。本试验从江西赣州18个县送本试验室检测的疑似患多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的156份病料中分离到127株细菌，采用细菌分离培养和生化试验进行初步鉴定，再用PCR检测的方法最终确定47株为HPS，并用琼脂扩散试验对分离菌株的血清型进行鉴定，了解副猪嗜血杆菌病在赣州地区流行情况，并通过药敏筛选分离株敏感药物，为该病的综合防控及治疗提供参考依据。

1 实验材料

1.1 病料来源

从江西赣州市18个县34个猪场共收集156病料，病猪出现呼吸困难、跛行，剖检可见浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。

1.2 试验试剂与仪器

副猪嗜血杆菌标准阳性血清1～15型，由本实验室保存、提供；微量生化鉴定试剂、TSA固体培养基，购自青岛易邦生物工程有限公司；新生牛血清，购自广州鼎国生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均为大连宝生物公司产品；SHP-250恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，PCR扩增仪购自美国PE公司。

2 试验方法

2.1 细菌分离鉴定

2.1.1 病原菌的分离。无菌操作从病猪的鼻腔、肺脏、胸膜、心包积液、关节液和脑组织等病料中取样，划线接种于含5%新生牛血清的TSA固体培养基，挑取单个疑似HPS的菌落纯培养后进行鉴定。

2.1.2 细菌形态鉴定。取单个菌落，经革兰氏染色后镜检，观察其形态及染色特性，保存，备用。

2.1.3 培养特性观察。取纯化菌落分别接种于普通血平板、普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基及含V因子LB培养基，37℃培养24h，观察菌落生长情况。

2.1.4 卫星试验。用接种环挑取可疑单菌落，水平划线接种于绵羊鲜血平皿，再挑取金黄色葡萄球菌垂直水平线划线，37℃培养24～48h，观察是否有“卫星生长现象”和溶血现象。

2.1.3 生化特性鉴定。取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于微型生化鉴定管，按厂家说明书方法操作并观察结果。

2.2 PCR鉴定

参照文献[3]方法从HPS培养物中提取DNA,参照Simone Oliveira等[4]报道方法进行PCR扩增试验。

2.3 血清型鉴定试验

根据蔡旭旺等[1]方法制备各分离菌株的血清学分型抗原，以各血清型标准血清对各分离株进行琼脂扩散试验，以确定各分离株的血清型。

2.4 药敏试验

将HPS接种于TSB培养基，37℃180r/min震荡培养12h后，用灭菌棉签沾取培养液均匀涂布于TSA培养基上，待稍干后，用无菌镊子将药敏试纸片平贴于培养基表面，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。

3 结果

3.1 细菌形态及镜检特征

取病料接种于含5%新生牛血清的TSA固体培养基，置于含5%CO2培养箱中37℃培养24h，共分离到细菌127株，纯培养后发现有47株细菌为圆形、光滑湿润、无色透明、直径为1～2mm左右的菌落，镜检可见革兰氏阴性短小杆菌，具有多种不同形态，从单个球杆菌到长的、细长的、丝状的菌体。

3.2 培养特性观察结果

将47株疑似菌纯培养物进行培养特性观察，发现均在麦康凯培养基和普通营养琼脂培养基上不生长;在普通血平板上长成细小、针尖状、半透明菌落；在含V因子血平板及含V因子LB培养基上长成灰白色、半透明、细小、露珠状菌落，边缘整齐、光滑、圆形、隆起，菌落直径约为1.0mm。

3.3 卫星试验结果

疑似菌在绵羊鲜血平板上与金黄色葡萄球菌垂直水平线划线，37℃培养24h后，呈现典型的“卫星生长现象”，并且在鲜血琼脂平板上的菌落周围不出现溶血现象。

3.4 生化鉴定结果

表1 生化试验结果

将疑似菌落接种于微量生化鉴定管，均出现表1所示结果。

3.5 PCR扩增反应结果

根据副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822bp大小的片段，与预期扩增片段大小相符。

3.6 血清型鉴定结果

将分离到的47株HPS，通过琼脂扩散试验进行血清型分型，结果如表2所示。4型和5型最为流行，其次是13和14型，另有3株不能确定血清型。4型和5型血清型病料主要来自定南、龙南、全南3个县，分别都是赣州地区生猪养殖规模较大的县。

表2 血清型鉴定结果%

3.7 药敏试验结果

如表3所示，分离株对喹诺酮类药物如诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等，以及头孢拉定、卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素敏感，但对红霉素和壮观霉素有抵抗力。

表3 药敏试验结果mm

4 讨论

副猪嗜血杆菌病可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，随着养猪业的发展，该病已经成为影响世界养猪业最重要的细菌性疾病之一。本试验对赣州地区副猪嗜血杆菌的病原学、血清流行病学和耐药性进行研究，为副猪嗜血杆菌病的基础研究及该病的诊断、预防与控制奠定基础。

经常发生该病的猪场，应该重视管理方面的问题，实行“全进全出”的饲养制度，做到严格分群饲养。对规模化猪场来讲，分娩舍一定要采用小单元的饲养模式，采用“全进全出”的饲喂体系，舍内保持合理的饲养密度，确保适宜的温度和优良的空气质量，严格禁止不同批次的猪只混养，减少、消除各类应激因素。由于HPS具有败血症的特征，发展迅速，且一周龄仔猪即可发病，因此提高母代的免疫力和天然的免疫力也是控制该病的关键。母猪接种后可使4周龄以内的仔猪产生保护性免疫力。另外，在管理中可采取措施预先让猪接触无致病力的副嗜血杆菌株，以培养后来的有毒株刺激的抵抗力。

[1]蔡旭旺，陈焕春，刘正飞，等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报，2005（24）：55～58.

[2]白文彬，于康震.动物传染病诊断学[M].北京：中国农业出版社，2002，447～483.

[3]奥斯伯F，金斯顿R F，塞德曼T G，等.精编分子生物学试验指南[M].颜子颖，王海林译，北京：科学出版社，1998，39.

[4]OLIVEIRAS,GALNAI,PIJOAN.Development of a PCR test to diagnose haemophilus parasuis infections [J].Jvetdiagn Invest,2001,13（6）:495～501.