基于盐度校正法的中国河口铅水生生物水质基准制定

单阳阳，李正炎,2,*

1. 中国海洋大学环境科学与工程学院，青岛 266100 2. 中国海洋大学，海洋环境与生态教育部重点实验室，青岛 266100

铅进入水生植物体内后，会改变细胞细微结构，继而抑制植物的光合作用、呼吸作用和酶活性；铅还会引起细胞核酸组成改变、细胞体积缩小从而抑制植物正常生长[1]。铅对水生动物不同阶段的生长发育均有影响：在精子和卵形成期，受到铅污染的精子常表现为顶体解体、顶体及核物质丢失等症状，从而失去正常受精能力并直接导致个体不育；在早期胚胎发育阶段，受精卵受铅污染后，常表现为胚胎畸形发育甚至死亡，从而导致种群数量下降[3-4]。铅也能通过食物链进入人体，继而对人体造血系统、神经系统、消化系统及相关脏器造成危害[5-6]，目前，铅已被世界各主要国家列为“优先控制污染物”。在2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，铅被列入2B类致癌物，即对动物为致癌物，对人类为可疑致癌物[7]。我国铅储量世界排名第二，近年消费量年均增长8.5%[8]，过量的铅给环境和人体健康带来巨大隐患。

水质基准是制定水质标准的科学和理论基础，也是水环境质量评价、环境风险评价、环境损害鉴定评估、水环境管理和相关政策、法律、法规制定的重要依据[9]。由于我国现行水质标准体系基本是参考国外和世界组织的水质标准制定，没有开展基于我国国情的的水质基准研究，导致现有水质标准无法客观真实反映我国水环境状况，使得我国环境保护工作一直存在“欠保护”和“过保护”现象[10]。“欠保护”可能对人体健康或生态系统造成危害，而“过保护”则导致环境保护成本增加，影响社会与经济发展。随着我国经济的快速发展和法律制度的逐步完善，建立更科学的水质基准和标准成为亟待解决的问题。

河口作为沟通河流和近海的区域，受河流和海洋相互作用影响，具有独特的环境特征和生物区系组成。河口环境中，盐度是影响铅毒性的首要因素[11]。简单套用目前现行的《地表水环境质量基准》(GB 3838—2002)或《海水水质标准》(GB 3097—1997)可能不足以保护河口生态环境；采用常规的水质基准推导过程也无法体现河口盐度变化对污染物毒性的影响。因此，本研究通过分析不同盐度下铅对河口水生生物的毒性数据，并补充相关试验，分析盐度与铅毒性效应之间的相关关系，最终制定出适用于我国河口环境的铅水生生物水质基准。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 毒性数据的搜集、筛选和处理

本文搜集和筛选的河口水生生物毒性数据主要来源于“中国知网”(http://www.cnki.com/)，美国环境保护局(US EPA)ECOTOX毒性数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)和其他公开发表的相关文献。为保证推导的基准值更符合我国河口水环境特征和生物区系组成，本文选用的物种皆为我国河口区域的广布种。选用的毒性数据来自于铅(Pb2+)的毒性试验，使用的铅化合物主要为硝酸铅(Pb(NO3)2)、氯化铅(PbCl2)、醋酸铅((CH3COO)2Pb)和氯化三甲基铅(trimethyl lead chloride)。

水质基准推导最核心的内容是对毒性实验数据的筛选，不同的实验数据将获得差异较大的水质基准，甚至是不可信的水质基准。数据的筛查范围应主要包括实验条件设计、实验对照、毒性终点选择、异常值剔除和数据选取原则等[12]。本文中毒性数据的筛选方法如下。

(1)首先根据上述筛选规定对文献调研及毒性实验所获得的数据进行一个初步的筛选。

(2)筛选毒性数据。用于推导短期基准的急性毒性数据，除枝角类和蚊类使用48 h且毒性效应终点为死亡、生长、发育和繁殖的半数致死浓度(LC50)或半数效应浓度(EC50)外，其他生物采用同上效应终点且暴露时间为96 h的LC50或EC50。用于推导长期基准的慢性毒性数据，采用暴露时间不小于14 d且毒性效应终点为生长、发育和繁殖的无观察效应浓度(NOEC)或最低可观察效应浓度(LOEC)。

(3)毒性数据处理。若同一物种有多个毒性数据，则采用暴露时间最长者。当一个测试物种有多个测试终点或生命阶段的毒性数据可用时，一般选择最敏感测试终点或最敏感生命阶段的毒性数据[13-15]。若同一物种、毒性终点和暴露时间有多个毒性数据，则采用这些数据的几何平均值。按物种分别对急性、慢性毒性数据进行分类和筛选，去除相同物种测试终点值中的异常数据点，即偏离平均值超过一个数量级的离群数据。所有毒性数据都需要有明确的受试盐度条件，用盐度对毒性数据进行校正和归一化。剔除非《中国动物志》、《中国植物志》、CNKI数据库中界定的本土物种以及只在实验室内养殖的实验生物及非河口的物种的毒性数据。

此外，需要对处理后的毒性数据进行可靠性判断，将数据依性质分为4个等级：无限制可靠数据(完全符合标准)、限制性可靠数据(部分信息缺失)、不可靠数据(不符合标准)和不确定数据(数据来自摘要或二次引用文献，缺乏相关信息)。数据质量可靠性评价包括5个方面：(1)试验设计，包括测试标准、操作规程、数据有效性和对照组设置；(2)试验试剂的纯度及其杂质的物理化学性质；(3)受试生物的基本信息和来源；(4)暴露条件，包括试验系统、暴露浓度设置及变化、暴露时间和生物负荷；(5)数据分析，包括平行样本、统计分析方法、浓度-效应关系和原始数据；数据使用规范主要考虑受试生物、测试终点和暴露场景与评价目标的相关性，以及生态风险评价和水质基准推导对数据精确性的要求[12]。具体标准详见美国[13,16]、加拿大[17]、澳大利亚和新西兰[18]等国家及欧盟[14,19]的水质基准推导和生态风险评价指南。

1.2 毒性数据的盐度校正

参考淡水中硬度对重金属毒性的影响研究，硬度较大的水体中较高的Ca2+、Mg2+含量对重金属的毒性有缓解作用[20-22]。盐度作为水中溶解物质质量与水质量的比值，较高盐度的水体中Ca2+、Mg2+含量较高，硬度与重金属毒性的关系可能复现在盐度与重金属毒性的关系中。参考淡水中相关方法，以毒性试验采用的盐度值为X轴，毒性数据的对数值为Y轴进行回归分析得到盐度校正斜率，根据该斜率对毒性数据进行盐度校正。

由于同种生物不同盐度下的铅毒性试验数据较缺乏，因此，本研究补充了中肋骨条藻和菲律宾蛤仔在不同盐度下的铅毒性试验。

1.2.1 试验材料

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)俗称蛤蜊、花蛤或蚬子，属软体动物门，双壳纲，帘蛤目，帘蛤科，是我国四大养殖贝类之一。其野生种群在我国南海、东海和黄海均有广泛分布。

中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)属于硅藻门，中心纲，圆筛藻目，圆筛藻科，是一种对赤潮敏感度较高的浮游藻类，在我国近岸地区普遍存在。

菲律宾蛤仔购自青岛晓翁海鲜水产批发市场，中肋骨条藻来自本实验室。实验使用的化学试剂(PbCl2、Pb(NO3)2等)购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯，实验前使用去离子水将各药物配成一定离子质量浓度母液备用。实验用水为人工海水，海水晶购自天津市海生海水晶厂，使用曝气48 h以上的自来水稀释海水晶得到不同盐度的人工海水，经高温消毒后，冷却备用。

1.2.2 试验方法

试验过程主要参照我国软体动物毒性试验相关方法和美国《生态效应测试指南》[23]。采用SPSS 24专业软件以概率单位回归法计算铅对菲律宾蛤仔的LC50，采用Origin 9.1以非线性拟合法计算铅对中肋骨条藻的EC50。

(1)菲律宾蛤仔的急性毒性试验。蛤仔壳长2.8～3.4 cm，壳厚0.7～1.2 cm，带回实验室后通气驯养2 d，后移入3 L的玻璃烧杯中(加入2 L人工海水)，每个烧杯放10只蛤仔，曝气培养，控制水温在(16±2) ℃。实验时选择大小相近、双壳紧闭、缩回反应迅速的个体。根据预实验结果，每个盐度下以等对数间距设置5个试验浓度(盐度20：1 000、2 340、5 477、12 819和30 000 μg·L-1；盐度25：2 000、3 936、7 746、15 244和30 000 μg·L-1；盐度32：6 000、10 440、18 166、31 609和55 000 μg·L-1)、1个空白对照组和1个溶剂对照组，每个浓度设置3组平行试验。试验期间不喂食，每24 h更换一次试验溶液，分别记录24、48、72和96 h时每个烧杯中蛤仔的死亡数目并及时挑出死亡个体。死亡判断依据为以玻璃棒轻触其水管，长时间无缩回反应。

(2)中肋骨条藻的急性毒性试验。在温度(20±2) ℃、光强60 μmol·m-2·s-1和光暗周期昼∶夜=14 h∶10 h的条件下，于250 mL的锥形瓶(经过高压蒸汽灭菌)中加入100 mL MAA培养基(配方如表1所示)，接种处于对数生长期的中肋骨条藻，初始接种密度约为1×104cells·mL-1。为避免每瓶试验藻所受到的光照不同而引起的试验误差，每天早晚摇动一次，并随机移动各瓶的位置。根据预实验结果按照等对数间距每个盐度下设置5个浓度(盐度20：300、798、2 121、5 641和15 000 μg·L-1；盐度25：300、857、2 449、6 999和20 000 μg·L-1；盐度32：300、949、3 000、9 487和30 000 μg·L-1)，1个空白对照组和1个溶剂对照组，每个浓度设置3组平行试验。实验过程中，分别在24、48、72和96 h用经过高压灭菌的枪头取1 mL藻液于小试管中，采用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪测定藻细胞叶绿素含量变化情况，用以表征藻细胞数量的变化。

表1 MAA培养基的配方Table 1 Formula of MAA medium

1.3 物种敏感度分布曲线拟合及河口水生生物水质基准推导

目前，国际上常用的水质基准制定方法主要包括毒性百分比排序法(SSR法)、物种敏感度分布法(SSD法)和评价因子法。本研究采用SSD法进行河口铅水生生物水质基准推导。用于拟合SSD曲线的模型众多(如BurrⅢ、Webull和Normal等)，但Wheer等[24]的研究表明，单一模型不能适用于所有污染物，对于不同污染物需要筛选合适的模型进行数据拟合，国内外利用SSD法进行水质基准研究时，采用的模型也各不相同。本文参考我国环境保护部2017年5月发布的《淡水水生生物水质基准制定技术指南》中推荐的模型，采用数据处理软件Origin 9.1和SigmaPlot 14.0内置的正态分布模型(Normal)、对数正态分布模型(Log-Normal)、逻辑斯蒂分布模型(Logistic)、对数逻辑斯蒂分布模型(Log-Logistic)和极值分布模型(Extreme value)这5种模型，拟合污染物毒性数据的概率分布。以铅毒性数据的对数值和累积概率为横纵坐标绘制SSD曲线，得出累积概率5%条件下的污染物危害浓度(hazardous concentration, HC5)。检验模型拟合优度的参数包括：决定系数(R2)、K-S检验值、均方根(RSME)和残差平方和(SSE)，R2越接近1、RMSE和SSE越接近0，模型拟合优度越高，K-S检验值>0.05，表明模型符合理论分布。本文中，水质基准采用双值基准体系：河口水质短期基准(Estuarine Water Quality Short-term Criterion, EWQSC)和河口水质长期基准(Estuarine Water Quality Long-term Criterion, EWQLC)。依据得到的HC5值进行水质基准计算，具体计算公式如下：

EWQSC=HC5急性/AF

EWQLC=HC5慢性/AF

式中：AF为评价因子，通常取值范围为1～5。当有效毒性数据量超过15个且覆盖足够的营养级(至少覆盖水生植物、无脊椎动物和脊椎动物3个营养级)时，AF取2。由于受慢性毒性试验方法和条件等限制，水质基准推导过程中常存在慢性数据不足的情况，因此，US EPA提出采用急慢性比率法(final acute chronic ratio, FACR)推导长期基准[13]，计算公式如下：

EWQLC=EWQSC/FACR

式中：FACR为最终急慢性比率，根据3科以上生物的急慢性比(acute to chronic ratio, ACR)计算，其中至少一种鱼类和一种无脊椎动物，FACR数值为所有物种ACR的几何平均值。

2 结果(Results)

2.1 筛选的毒性数据

经筛选，获得的铅对河口水生生物的急性毒性数据涵盖9门20科27物种(表2)，慢性毒性数据包括4门6科6物种(表3)。筛选得到的毒性数据基本覆盖了我国河口分布的主要物种。

表2 铅对我国河口水生生物的急性毒性Table 2 Acute toxicity of lead to estuarine species in China

表3 铅对我国河口水生生物的慢性毒性Table 3 Chronic toxicity of lead to estuarine species in China

2.2 盐度对铅毒性的影响

2.2.1 试验结果

在不同盐度下，铅对中肋骨条藻和菲律宾蛤仔的96 h急性毒性LC50、EC50如表4和表5所示。可见，同一试验条件下，不同盐度会造成铅毒性效应的差异，随盐度升高，铅的毒性效应下降；对于不同生物，盐度对铅毒性效应的影响程度也有不同(图1)。

图1 盐度对菲律宾蛤仔和中肋骨条藻铅毒性的影响Fig. 1 Effect of salinity on lead toxicity to Ruditapes philippinarum and Skeletonema costatum

表4 不同盐度条件下铅对中肋骨条藻96 h急性毒性的拟合曲线Table 4 96 h acute toxicity of lead to Skeletonema costatum under different salinity

表5 不同盐度条件下铅对菲律宾蛤仔96 h急性毒性的拟合曲线Table 5 96 h acute toxicity of lead to Ruditapes philippinarum

2.2.2 盐度校正

盐度对铅毒性效应的影响程度因生物类别而异，不同门类生物毒性数据和盐度的相关性分析如表6所示。可见，对于不同门类生物，盐度对其毒性值的影响程度不同，其中，节肢动物门的生物毒性值与盐度的相关程度最低，硅藻门的生物毒性值与盐度相关程度最高。因此，本文以门为尺度计算得到不同门类生物的盐度校正斜率。但个别门类生物毒性数据量较少，难以得到准确的盐度校正斜率，这些生物的盐度校正斜率采用全部门类生物的盐度校正斜率(图2)。

图2 水体盐度对不同门类生物铅毒性影响的回归分析Fig. 2 Regression analysis on the effect of water salinity to lead toxicity of different species of Phyla

经计算得到脊索动物门、软体动物门、节肢动物门和硅藻门的盐度校正斜率分别为0.088、0.142、0.014和0.066，针对所有门类生物的盐度校正斜率为0.026。盐度对不同门类生物铅毒性的影响程度从大到小依次为软体动物门、脊索动物门、硅藻门和节肢动物门。本研究收集到的毒性数据的盐度范围为4～36，均值约为28，利用上述盐度校正斜率将急性毒性值调整至平均盐度对应的毒性值后，计算种平均急性值(species mean acute value, SMAV)。

2.3 铅的河口水生生物水质基准

基于现有的SMAV进行K-S检验，经检验，毒性数据的对数值符合正态分布(均值8.16，标准偏差0.09)(图3)。

对所有急性毒性数据经对数转换后构建SSD曲线。由表7可知，Normal拟合模型得到的R2最大，RMSE和SSE最小，K-S检验结果>0.05，故Normal模型为最优拟合模型(图4)，该模型下获得的急性毒性HC5为4.578 μg·L-1，由于急性毒性数据大于15个并涵盖了足够的营养级，故AF取值2，得到EWQSC为48.68 μg·L-1。由表3可知，慢性毒法性数据量不满足美国水质基准指南中“3门8科”的生物毒性数据量的要求，因此，采用FACR进行EWQLC的推导。根据3个物种计算得到的FACR值为8.70(表8)，该值与经济合作与发展组织(OECD)[52]和澳大利亚[53]推荐使用的ACR默认值10接近。经计算得到EWQLC为5.60 μg·L-1。

表6 水体盐度对不同门类生物铅毒性影响的相关性分析Table 6 Correlation analysis on the effect of water salinity on lead toxicity of different species of Phyla

表7 铅对我国河口生物急性毒性值的不同分布模型拟合结果Table 7 Fitting results of acute toxicity data of lead to estuarine organisms in China by different distribution models

图4 铅对我国河口生物急性毒性值的物种敏感度分布曲线Fig. 4 The species sensitivity distribution curve of lead acute toxicity to estuarine organisms in China

3 讨论(Discussion)

3.1 影响铅生物毒性的主要因素

较高的水体盐度对铅的毒性有缓解作用[54]。与盐度为20的水体相比，铅对墨吉对虾的毒性在盐度为35的水体中明显降低[40]。本研究通过实验也证实了相同试验条件下，盐度较低水体中铅对菲律宾蛤仔和中肋骨条藻的毒性效应明显大于盐度较高的水体。该现象同样出现在其他生物中，尤其是甲壳类生物[55-58]。Sullivan[59]认为血淋巴和外部介质之间的渗透压梯度影响金属的生物可利用性，在低盐度下，金属更易被生物摄取，从而造成更高的毒性。阳离子竞争也是引起盐度效应的重要因素，研究表明，低盐度水体下比目鱼卵的死亡率明显高于高盐度水体[54]，其作用机理可能为：高盐度条件下，阳离子积累于比目鱼卵表面的绒毛膜，从而阻碍了重金属进入卵细胞，引起重金属毒性的降低[54]。此外，盐度可能会导致渗透压调节系统的损伤，引起铅化学形态的变化，从而影响铅的生物毒性[60-61]。

除盐度外，其他环境因素如pH、有机物含量等也会对铅的毒性产生一定的影响，它们会引起铅在各形态之间转化，从而影响铅的毒性。铅的化学形态与其毒性密切相关，水体中铅的主要成分为PbCO3、PbCl+、PbCl64-和Pb(CO3)22-，还有一部分铅以有机铅化合物形态存在于水体中，有机铅的毒性远大于无机铅[62]；Preston[63]研究发现，酸性pH下铅离子多为游离态，此时更容易被生物吸收，导致铅的毒性增强。此外，pH也影响生物膜吸收重金属的速度，pH较低时，生物膜吸收铅的速率加快，引起更高的毒性效应[64]。但迄今为止，多数毒性试验未将pH/有机物含量列为常规待测项目，同时也缺乏分析pH/有机物含量与铅毒性关系的相关研究，故不足以准确分析pH/有机物含量与铅毒性效应之间的相关性。因此，本研究未考虑pH和有机物含量对铅毒性效应的影响，在今后铅的水质基准研究中有待进一步探索和修正。

3.2 本文建议的基准值与国内外其他基准值的比较

如表9所示，与美国海水铅水质基准(287.0 μg·L-1)相比，本研究推导的短期水质基准(48.68 μg·L-1)远低于美国，长期水质基准(5.60 μg·L-1)则和美国相近；与美国淡水铅水质基准相比，本研究的短期水质基准略低于美国(65.0 μg·L-1)，长期水质基准明显低于美国(25.0 μg·L-1)。笔者认为造成这种差异的原因可能有以下5个方面：(1)美国采用毒性百分比排序法计算水质基准，而本研究采用物种敏感度分布法选择最佳拟合模型外推得到铅的基准值，可以有效避免个别毒性数据过大或过小引起水质基准偏差，美国现行的铅水质基准可能存在“过保护问题”；(2)中国和美国推导基准时所采用的生物物种不同，而这些物种由于生理构造、生活环境和地理分布等的差异导致对化学物质的敏感性存在差异。本研究针对的是河口生物，生物组成与淡水和海水

表8 用于推导铅最终急慢性比率(FACR)的毒性数据Table 8 All the toxicity data for deriving final acute to chronic ratio (FACR) of lead

表9 不同国家铅水质基准及标准值Table 9 The water quality criteria or standards of lead in different countries

不尽相同，导致所推基准值差异较大；(3)美国推导基准时没有使用藻类数据[66]，而本研究搜集到的毒性数据表明，一些藻类，如孔石莼[48]，对铅也有极高的敏感性，且藻类是海洋重要的初级生产者，藻类数据缺乏可能会对最终基准值产生一定影响。美国的铅水质基准于1984年颁布，毒性数据只筛选到1984年[66]，而本文筛选的毒性数据截止到2019年4月，两者毒性数据的数量和种类存在很大差异；(4)由于河口盐度变化会影响铅的毒性，本研究进行了盐度校正，美国的海水和淡水基准研究均未采用盐度校正；(5)推导慢性水质基准时，美国采用的FACR值缺乏鱼类数据，导致该值远大于其他国家或地区的推荐值。

本文所制定的河口基准值较洪鸣等[65]和何丽等[67]得到的海水基准值和淡水基准值也存在一定差异。其中，河口短期基准(48.68 μg·L-1)远小于海水短期基准(275.0 μg·L-1)，略小于淡水急性基准(65.0 μg·L-1)；长期基准(5.60 μg·L-1)均略大于海水(5.36 μg·L-1)和淡水基准值(5.10 μg·L-1)。笔者认为造成这种差异的原因可能有以下2个方面：(1)其他研究者采用的生物种类与本文存在较大的差异，本文选择的生物均为生活在我国河口的物种，对于我国河口而言具有较高的代表性，而其他研究者采用的生物为生活在淡水或海水的物种；(2)虽然均用SSD法进行基准值的推导，但采用不同的拟合模型亦会造成所推导基准值的差异。Maltby等[70]分析了10种模型的拟合效果，分别分析了各种模型拟合的准确率，如表10所示。由此可知，本文选取的3类模型均具有较高的准确率，并且该3类模型本身统计学应用理论成熟，已在多种研究中得以应用，目前现行的《淡水水生生物水质基准制定技术指南》同样推荐采用这些模型进行水质基准的推导，而其他研究者推导水质基准值时距今时间较久，未能完全采用这3类模型，故而造成所推基准值的差异。

这表明，采用的不同毒性数据和研究方法会造成所推导基准值的差异，因此，针对不同区域，需要根据其环境特征及生物区系组成制定特定基准值。此外，本文推导的长期基准高于我国的一类、二类海水标准，低于三类海水标准，略高于渔业水质标准；短期基准高于我国的一类、二类和三类海水标准，低于四类海水标准，可见，借鉴国外水质标准所制定的海水水质标准，并不完全符合我国国情，也不符合河口环境保护的特殊需要，存在“过保护”现象。

表10 各类统计模型的拟合结果Table 10 Fitting results of various statistical models (%)

本研究取得主要结论如下：

(1)铅的毒性效应受盐度影响，随盐度升高表现为毒性下降，不同门类的生物具有不同的盐度校正斜率，其中脊索动物门、软体动物门、节肢动物门和硅藻门的盐度校正斜率分别为0.088、0.142、0.014和0.066，考虑所有生物门类的盐度校正斜率为0.026。

(2)以物种敏感度分布法为基础，采用Normal、Log-normal、Logistic、Log-logistic和Extreme value共5种模型对河口铅毒性数据进行拟合，发现Normal模型拟合效果最佳，在此基础上得到我国河口铅的长期和短期水质基准值分别为48.68 μg·L-1和5.60 μg·L-1。