量子点对Cu2+诱导L02细胞毒性的影响及机理研究

赵宇侠，李晨红，黎文明，王志正，韩秋琴，陈培清

1. 上海健康医学院协同科研中心，上海 201318 2. 国立药材研究院人参医药研究中心，越南胡志明市 800010

量子点(QDs)一般由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素构成，也称半导体纳米微晶体，由于其粒径很小(约2～10 nm)，电子和空穴被量子限域而被称为量子点。QDs以其稳定的荧光性和不易降解等特点在生物和医学领域中用于体内成像及细胞标记[1-5]。此外，QDs的小粒径及大比表面积也赋予了其高反应活性，这使得QDs很容易与共存环境的其他物质以各种方式结合，比如QDs能够结合Cu2+，并且基于结合后量子点荧光变化的特性衍生出用QDs检测Cu2+浓度的方法[6-7]。

铜元素是生物体正常生命代谢活动过程必需的微量矿质元素，主要以酶结合金属的形式广泛参与各种生命活动。铜构成了多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、多胺氧化酶和锌超氧化物歧化酶(Zn-SOD)等的蛋白质的重要辅因子，主要通过参与呼吸代谢中的氧化还原反应来参与代谢；然而，尽管铜是生物体所必需的元素，稍微过量的铜便会干扰细胞代谢和离子平衡，对生物体乃至生态系统的微生物和植物产生毒害作用[8-9]。肝脏是Cu2+蓄积的重要靶器官。Cu2+的蓄积会诱导细胞毒性，很多铜代谢相关的缺陷导致Cu2+在肝脏内缓慢蓄积最后导致肝脏疾病[10-12]。

QDs在生物医学的应用带来了更多的人体暴露机会[13]。铜的主要的暴露路径是摄食[14]。肝脏是众所周知的Cu2+富集的靶器官。QDs被证明可以在生物体内系统分布并主要滞留在肝脏内[15]。因此，QDs和Cu2+可能在肝脏内共存并且QDs能够结合肝脏环境中的Cu2+，而QDs作为纳米材料曾被证明容易绕过细胞膜屏障进入细胞，并且QDs产生的活性氧自由基(ROS)有破坏细胞膜的作用，那么两者共存可能通过QDs破坏细胞膜，使得Cu2+容易进入细胞，导致细胞Cu2+蓄积量增加，从而带来细胞毒性增加，引发肝脏疾患的风险。

本研究用人胚肝细胞(L02细胞)作为肝脏的指示细胞，调查QDs的加入对于Cu2+细胞毒性的改变，同时考察QDs对Cu2+细胞蓄积量的影响，该影响可能解释细胞毒性的增加。进一步考核细胞内Cu2+泵出蛋白表达的变化验证以上的Cu2+蓄积带来的细胞应激变化，通过测定乳酸脱氢酶(LDH)的变化确定细胞膜的破坏，佐证QDs可能通过破坏细胞膜辅助Cu2+进入细胞。本研究旨在阐述QDs和Cu2+的共存对肝脏的可能威胁，以期为纳米材料可能的体内和环境风险评价提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

实验所用的人胚肝细胞(L02细胞)购自中国科学院细胞库。

1.1.2 试剂

无水氯化铜，分析纯，购自Sigma试剂公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco®公司；MTT Cell Proliferation Assay Kit购自北京赛驰生物科技有限公司；Cyto Tox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司；量子点CdTe-MPA(巯基丙酸)由华东理工大学化工学院合成，包覆MPA，直径为3.7 nm，发红光，在水相中合成的发射波长为628 nm，物质的量浓度为5.8×10-6mol·L-1，质量浓度为0.64 mg·mL-1，在pH值6～12范围内稳定，合成方法参见参考文献[2]，合成后离心收集，用丙醇纯化以去除杂质。

1.1.3 仪器

UV7500紫外-可见分光光度计，上海天美生物科技有限公司；F7000型荧光光谱仪，日本日立公司；Tecnai G2 20型透射电镜(TEM)，美国FEI公司；Malvern Zetasizer Nano ZS 90型动态光散射仪(DLS)，英国马尔文仪器有限公司；7700型等离子体质谱(ICP-MS)仪，美国Agilent公司；Molecular Imager ChemiDocTMXRS+imaging System凝胶成像系统，BIO-RAD公司；BioTek Synergy2多功能酶标仪，美国BioTek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 QDs样品表征

样品在工作电位为200 kV时测定TEM图像；用UV7500紫外-可见分光光度计在光程1 cm的光谱池测定样品紫外光谱，发射光谱在F7000型荧光光谱仪上测定。采用动态光散射法对QDs的水合粒径进行测定，测定条件为25℃，散射角90°，激光波长633 nm。

1.2.2 细胞培养方法

L02细胞用DMEM培养基加入10%的胎牛血清(FBS)在37 ℃、湿度为95%和5%的CO2条件下培养。

用不同浓度的Cu2+(0、5、10、20和40 μg·mL-1)溶液单独或与QDs(200 μg·mL-1)联合处理细胞，培养24 h后，用于各项分析。QDs从10 mg·mL-1的无血清的培养基配制的母液稀释得到，Cu2+溶液从无菌超纯水配制的30 mg·mL-1的母液稀释得到。

1.2.3 MTT法测定细胞存活率

取对数生长期细胞接种于96孔板(104个·孔-1)，培养使细胞贴壁，弃培养液，每孔加入含Cu2+或QDs-Cu2+的培养基，Cu2+浓度分别为0、5、10、20和40 μg·mL-1，QDs的浓度为200 μg·mL-1，每个剂量组设定3个复孔置于5% CO2培养箱培养24 h后，在光学显微镜下观察细胞形态学变化[14]。然后弃去每孔中的培养液，加入含10%噻唑蓝(MTT)(5 mg·mL-1)的DMEM培养基(无FBS)，继续培养4 h后，弃去MTT溶液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μL后，充分振荡至紫色的甲臜结晶完全溶解后，用BioTek Synergy2多功能酶标仪测定在490 nm波长处的吸光度值，确定相对于Cu2+单独处理组，QDs的加入对L02细胞存活率的影响[16-17]。

1.2.4 LDH释放的检测

取对数生长期细胞接种于96孔板(104个·孔-1)，细胞贴壁后，选择0、10、20和40 μg·mL-1的Cu2+单独及与200 μg·mL-1的QDs联合处理细胞24 h，根据Cyto Tox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒实验步骤操作，用酶标仪在490 nm下测定吸光度。

1.2.5 总蛋白提取和蛋白印迹实验(Western blot)

细胞培养和处理同LDH实验，给予药物处理24 h后，置于冰浴，用提前预冷的PBS(含蛋白酶抑制剂)清洗细胞2次，加5 mL冷的PBS洗涤，用细胞刮片收集细胞，4 ℃、300×g离心5 min，去上清液，加入1 mL总细胞裂解液，冰浴5 min，4 ℃、16 000×g离心5 min，取上清，BSA作为标准蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度后加入蛋白上样缓冲液并于100 ℃下蛋白变性5 min，-80 ℃备用。

制备8%～10%的SDS-PAGE胶，上样，以80 V电压电泳，待条带跑入分离胶部分，提高到120 V，跑至距离玻璃板底部1 cm左右停止并开始转膜。电流调到350 mA，NC膜低温湿转，转膜1～2 h，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h，加对应的一抗(按比例1∶1 000稀释)与目的蛋白特异性结合，4 ℃孵育过夜，TBST溶液清洗一抗，加对应二抗(比例1∶1 000稀释)，室温轻摇孵育1 h，TBST漂洗3次后ECL液显色，并在凝胶成像系统上显影，并利用Image J软件分析各组条带的灰度值，以GAPDH为内参计算各组蛋白的变化情况。

1.2.6 细胞内Cu2+含量检测

细胞接种于6孔板(105个·孔-1)，处理浓度同上，培养24 h后，离心5 min(5 000 r·min-1)，细胞残留的上清液从孔中吸出，细胞用PBS缓冲液洗2次以除去细胞表面残留的Cu2+。200 μL的Tritonx-100(0.5%质量浓度)溶液加入孔中以裂解细胞。细胞再放入-20 ℃的冰箱中反复冻融直至完全裂解。离心10 min(10 000 r·min-1)，收集上清液采用火焰原子吸收光谱法，以铜特征线(共振线)324.7 nm为分析线，用ICP-MS仪检测Cu2+浓度，每个实验设3组平行。

1.2.7 统计分析

数据以均数±标准差(x±s)表示，应用Origin7.5软件对数据进行单因素方差分析和T-test检验，*表示以P<0.05置信度下的差异有显著性，代表QDs-Cu2+联合处理样品相比于单独Cu2+处理的差异显著。

2 结果(Results)

2.1 QDs纳米粒子的表征

如图1(a)所示，合成的量子点CdTe-MPA纳米粒子的尺寸较均匀，大致呈球形，平均粒径约为2～10 nm。DLS结果显示QDs水合粒径为100 nm左右，在水溶液中会有部分团聚，分散较均匀(图1(b))；紫外可见吸收光谱法测得QDs在530 nm以下吸收较好(图1(c))；荧光强度在610 nm左右达到峰值(图1(d))。

图1 量子点(QDs)的表征和荧光光谱注：CdTe-MPA QDs的TEM图(a)；CdTe-MPA QDs的动态光散射(DLS)表征(b)；QDs的紫外吸收光谱(c)；QDs的荧光光谱(d)。CdTe-MPA QDs为巯基丙酸包覆的CdTe量子点。Fig. 1 Characterization of quantum dots (QDs) and fluorescence spectraNote: TEM of CdTe-MPA QDs (a); Dynamic light scattering (DLS) analysis of CdTe-MPA QDs (b); Ultraviolet absorption spectra of QDs (c); Fluorescence spectra of QDs (d). CdTe-MPA QDs represents mercaptopropionic acid-coated CdTe QDs.

2.2 QDs对Cu2+诱导的细胞毒性的影响

用MTT实验和细胞形态变化来评估QDs对Cu2+诱导的细胞毒性。结果表明，QDs作用24 h后，对L02细胞的毒性较低，单独的200 μg·mL-1QDs细胞致死率约为3.6%(表1)；不同浓度的Cu2+处理24 h后，随着剂量的增大，细胞增殖能力明显下降，呈剂量-效应关系；200 μg·mL-1QDs的加入能显著提高Cu2+的毒性，其中细胞毒性最大提高了26.0%，表现为协同作用(图2(a))。

图2 QDs的加入对Cu2+诱导的细胞毒性的影响注： Cu2+和QDs-Cu2+处理对L02细胞存活率的影响(a)；Cu2+(10 μg·mL-1)、QDs(200 μg·mL-1)及QDs(200 μg·mL-1)联合Cu2+(10 μg·mL-1)处理的细胞形态变化(b)。Fig. 2 Effect of QDs on Cu2+-induced cell viability decreaseNote: Effect of Cu2+ and QDs-Cu2+ treatment on the survival rate of L02 cells (a); Morphological changes of cells treated with Cu2+(10 μg·mL-1) and QDs (200 μg·mL-1) and QDs (200 μg·mL-1) combined with Cu2+(10 μg·mL-1) (b).

通过在光学显微镜观察各处理组的细胞形态变化(图2(b))，结果基本和MTT实验一致。对照组为正常的L02细胞，呈多边形，具有完整的细胞核，并且折光性和贴壁状态也很好。相对于Cu2+处理组而言，QDs的加入使细胞受到更加明显的伤害。在显微镜下观察可见，活细胞数量减少，明显出现细胞间质消失、细胞体积缩小和细胞核浓缩等各种程度的异常形态变化。

2.3 QDs及Cu2+对细胞膜的影响

通过测定LDH释放率来考察QDs对细胞膜的破坏作用，从而推测细胞毒性机理。由图3可知，不同浓度Cu2+处理组在加入200 μg·mL-1QDs后，均表现出LDH释放量增加，且随着Cu2+处理的浓度增加，LDH释放率变化量增加，其中相对于对照组，单独QDs(200 μg·mL-1)处理组，LDH释放率增加了2.8%；加入200 μg·mL-1QDs后，相对于单独10 μg·mL-1Cu2+处理组，LDH释放率增加了23.6%。

表1 QDs和Cu2+对L02细胞存活率的影响Table 1 Effects of QDs and Cu2+ on the survival rate of L02 cells

图3 Cu2+单独及联合QDs对L02肝细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响Fig. 3 Effects of Cu2+ alone and combined with QDs on lactate dehyfrogenase (LDH) release from L02 hepatocytes

2.4 细胞内Cu2+含量变化

为了进一步确证QDs的加入带来细胞毒性的增加，用ICP-MS仪检测细胞内实际Cu2+含量。由图4可知，不同浓度Cu2+联合QDs(200 μg·mL-1)作用于L02细胞24 h后，均表现出明显的细胞Cu2+蓄积量增加，相对于对照组，单独QDs(200 μg·mL-1)组细胞Cu2+含量增加了6.4%；相对于单独Cu2+(10 μg·mL-1)组，加入QDs(200 μg·mL-1)后，Cu2+细胞蓄积量明显增加，增加了431.8%。

2.5 Cu2+解毒蛋白表达结果

Western blot法检测Cu2+天然解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1表达情况，发现解毒蛋白表达量增加，也从侧面证明了，Cu2+在细胞内蓄积量确实增加，这才导致解毒蛋白表达增加，与QDs(200 μg·mL-1)可能对细胞膜产生破坏作用导致Cu2+蓄积这一推测相一致。如图5可知，10 μg·mL-1Cu2+联合200 μg·mL-1QDs处理组，相对于单独Cu2+处理组，解毒蛋白表达不同程度地增加，ATP7A蛋白增加了133.6%，CTR1蛋白增加了57.3%。

图4 QDs-Cu2+联合对L02肝细胞内Cu2+含量的影响Fig. 4 Effect of QDs-Cu2+ combination on Cu2+ content in L02 hepatocytes

3 讨论(Discussion)

无毒的QDs由于粒径很小(约2～10 nm)，受小尺寸效应和表面效应等的影响，具备很多优异的性质，是近年使用率最多的新型纳米材料之一[5,18]。其生产量的增加不可避免地带来环境排放量的增加[19]，而且太阳能电池、计算机、生物传感器、成像技术、药物传递和光电探测器等方面的应用可能带来QDs的体内蓄积[1-5]。Rocha等[20]证明了QDs在体内主要在肝脏中蓄积。同时，由于工业和自然地理等原因造成Cu2+环境污染，并且作为人体必需元素也主要富集于肝脏[21]。所以，QDs和Cu2+的联合毒性的评价和相应机理以及防护措施的研究等尤其必要。

图5 Cu2+解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1蛋白的表达注：Cu2+解毒蛋白的Western blot结果(a)；不同处理对ATP7A表达的影响(b)；不同处理对CTR1表达的影响(c)。1. 对照组，2. Cu2+(10 μg·mL-1)，3. Cu2+(10 μg·mL-1)+QDs(200 μg·mL-1)，4. QDs(200 μg·mL-1)。Fig. 5 Expression of Cu2+ detoxification protein ATP7A, ATP7B and CTR1Note: Western blot results of Cu2+ detoxification protein (a); Effects of different treatments on ATP7A expression (b); Effect of different treatments on CTR1 expression (c). 1. Control; 2. Cu2+(10 μg·mL-1); 3. Cu2+(10 μg·mL-1)+QDs(200 μg·mL-1); 4. QDs(200 μg·mL-1).

QDs毒性机理中有一个通过活性氧簇(ROS)导致细胞膜破坏，使得细胞的屏障作用消失[10,19]。另外，Cu2+要克服细胞天然的屏障作用，离细胞足够近才能发挥毒性，而此时细胞的天然屏障作用相当于被QDs破坏，有了QDs的“辅助”作用，使得Cu2+能够靠近细胞，细胞内Cu2+蓄积量增加，导致细胞毒性增加。

一般而言，细胞都有对应的金属离子的天然解毒蛋白，会防止其过度蓄积[22-23]，比如Cu2+拥有天然的解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1等蛋白。现解毒蛋白在QDs加入后，表达量确实增加，说明QDs的加入造成Cu2+蓄积量的增加，导致解毒蛋白的表达量增加，细胞自身试图降低Cu2+蓄积量，以缓冲Cu2+带来的毒性作用。因此，关注无毒QDs或低毒QDs与Cu2+的复合毒性是有必要的。

QDs浓度为200 μg·mL-1时，L02细胞致死率为3.6%。Cu2+浓度为10 μg·mL-1时，L02细胞致死率为16.3%，当加入200 μg·mL-1QDs时，致死率变为33.5%，提高了17.2%，说明QDs和Cu2+的加入都会对L02细胞产生毒性，并且QDs的加入对Cu2+诱导的L02细胞毒性具有显著协同作用;细胞膜完整性被破坏的指示物LDH增加，Cu2+的解毒蛋白增加，这证明QDs对Cu2+诱导L02细胞毒性增加的机理可能是通过破坏细胞膜作用导致Cu2+蓄积量增加。