近红外荧光探针和成像系统临床转化应用的初步探索

谭 旭，王 钰，陈泽林，隆 磊，刘运胜，王 平，史春梦

(1.陆军军医大学,重庆 400038；2.华中科技大学，武汉 430063)

0 引言

近红外荧光成像作为一种新兴的生物医学成像模态,被广泛应用于基础科学研究以及临床实践,其核心在于研究开发具有疾病特异性靶向的近红外荧光探针和对应的成像检测设备。利用生物组织对近红外光(通常指近红外1区：700～900nm)的散射、吸收以及自发荧光显著较低的特点，能获得清晰的疾病组织结构图像进而引导对疾病组织精确切除[1]。吲哚菁绿[ICG(Indocyanine Green)；发射波长～800 nm]，作为目前美国食品和药物管理局(FDA) 唯一批准的近红外荧光分子，已有50余年的临床应用历史。作用于视网膜和脉络膜血管造影[2]、肝清除能力评估、胃肠道造影[3]、胆管造影[4]、输尿管造影[5]、冠状动脉造影[6]、甲状旁腺造影[7]、肿瘤前哨淋巴结造影[8]以及成像引导下的肿瘤组织切除，如原发肝癌和结肠癌肝转移病灶切除[9-12]，但是对于ICG在复杂创面中的应用尚缺乏研究。虽然ICG具有良好的临床应用价值，但由于其体内半衰期短、难以被细胞特异性摄取以及缺乏疾病特异性靶向蓄积，将极大地限制其临床应用前景。因此，亟需研发疾病选择性蓄积的新型近红外荧光探针[13]。目前用于临床术中近红外荧光成像的设备以美国的(Mini-FLARE)、法国的(Fluobeam)、加拿大的(SPYTM)以及日本的(PDETM)为代表[10]。它们均配备一个可移动的手持式探头，其可以同时激发检测区域并接收近红外荧光信号。这些系统能够通过实时术中显影将肿瘤、血管和淋巴结等组织结构清晰地展现在外科医生的手术视野中进而帮助它们准确地确定切除范围。上述临床手术导航系统虽然表现出良好的应用价值，但由于均为进口设备，相关研制技术对我国严格保密并被限制出口。因此，独立自主地研究开发近红外荧光手术导航系统具有重大的意义。本研究报道课题组围绕近红外荧光成像探针、成像系统和临床转化评价开展的探索研究，为开发近红外荧光成像的临床应用价值提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 仪器设备

近红外荧光成像系统Fluobeam及近红外荧光成像系统TPS-785-Ⅲ样机(武汉华眸光电科技有限公司研制)，具备术中实时成像、精确定位疾病(如肿瘤)并清晰分辨疾病边界以及同步采集可见光图像与近红外荧光图像等功能。Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System，具有小动物活体荧光成像效果，同时基于其采集X-ray影像图像的能力，精确定位疾病的解剖部位。

1.2 一般资料

纳入研究代表性复杂创面病例包括：糖尿病右足踇趾溃疡兼远节部分缺如患者和右手木炭火焰烧伤儿童患者；通过全身静脉给予ICG后行损伤局部血管近红外荧光成像；另纳入结肠癌患者手术切除肿瘤组织离体标本经IR-780局部灌注后进行近红外荧光成像。

1.3 近红外荧光成像

对于糖尿病右足踇趾溃疡兼远端部分缺如患者及手部烧伤患者进行损伤局部血管成像，于术前静脉注射0.5 mg/kg ICG，然后立即于术中采集近红外荧光图像。对于结肠癌患者手术切除离体标本肿瘤及淋巴结显影，获取结肠癌患者手术切除的新鲜标本(0.5 h以内)后，将IR-780通过残端动脉直接灌注到标本中，4 h后进行肿瘤及淋巴结近红外荧光成像检测，并将对应肿瘤组织及淋巴结进行冰冻切片，DAPI染色后通过激光共聚焦检测IR-780的细胞摄取情况。

2 结果2.1 ICG对复杂创面的在体血管成像与评价

结果如图1所示，由于损伤局部的血管及淋巴

图1 ICG血管造影评估损伤局部血供情况A. 右足踇趾溃疡兼远端部分缺如患者的损伤局部血管造影；B. 右手木炭火焰烧伤患者的损伤局部血管造影

压力不同，ICG能够被动地扩散蓄积到损伤局部。基于近红外荧光成像系统Fluobeam获得的近红外荧光造影结果发现损伤局部的近红外荧光信号出现更早、更强且持续时间更长。如图1 A显示，右足踇趾溃疡兼远端部分缺如患者的损伤局部在注射ICG后7 s即显现出强烈的荧光信号，在13 s左右达到最强后急剧降低并维持稳定，而其左侧正常踇趾在注射后30 s才出现较为明显的荧光信号，在45 s左右达到最强并缓慢降低，在注射后120 s两侧踇趾荧光信号强度均显著降低且两者之间无明显差别。如图1B显示，右手木炭火焰烧伤患者的损伤局部在注射ICG后23 s检测出强烈的荧光信号，在27 s左右达到最强，而其左侧正常手部在注射后35 s才出现较为明显的荧光信号，在50 s左右达到最强并缓慢降低，在注射后180 s后左侧手部荧光信号消失而右侧损伤手部仍残留比较明显的荧光信号。

2.2 IR-780对手术切除肿瘤组织的特异性识别及淋巴结成像

针对代表性病例，将IR-780通过残端动脉灌注的方式直接将其注入临床结肠癌病人标本中，37℃孵育4 h后通过Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System进行近红外荧光成像检测，结果如图2A所示，IR-780能够识别出局部的肿瘤病灶

图2 IR-780的肿瘤特异性识别及淋巴结显影A. 结肠癌标本的X-ray成像及特异性IR-780近红外荧光成像图片；B. 从结肠癌标本中分离的淋巴结近红外荧光成像及激光共聚焦检测图片

(蓝色箭头所指部位)。进一步通过触摸的方法分离出 8个淋巴结，其中6个有较强的IR-780荧光信号。分别挑选780阳性和阴性荧光信号淋巴结(②和①)制作冰冻切片并进行DAPI染色，然后通过激光共聚焦检测IR-780的细胞摄入情况。结果如图2B所示，在IR-780阳性信号淋巴结中检测到对IR-780特异性摄入的细胞，推测这些细胞可能为转移到淋巴结的肿瘤细胞。

2.3 近红外成像系统TPS-785-Ⅲ的功能评价

基于上述研究基础，开展对国产近红外应成像系统TPS-785-Ⅲ的评价研究，如图3A和图3B所示，该系统通过术前给受检测对象注射近红外荧光探针，利用探针在病变部位选择性地蓄积特性，然后通过近红外光源(700～900 nm)激发探针获得比激发光源波长更长的近红外荧光信号，同时通过近红外相机和彩色相机的信号接收器(CCD)分别接收荧光信号和可见光信号，并通过信息处理后将成像图片显示在显示屏幕上。本成像系统具有高度集成便捷、成像速度快(30 fps)、成像视场大(100 mm×100 mm)、空间分辨率高以及同步采集可见光彩色图像与近红外荧光图像等主要优势。建立4T1乳腺癌荷瘤C57小鼠模型，尾静脉注射IR-780,24 h后通过TPS-785-Ⅲ近红外手术导航系统采集近红外荧光成像图像。结果如图3C和图3D所示，IR-780具有良好的肿瘤靶向显影能力，显示出TPS-785-Ⅲ系统具有良好近红外成像功能。

图3 TPS-785-Ⅲ近红外荧光成像系统的外观、工作原理以及应用实例A. TPS-785-Ⅲ近红外荧光成像系统外观图片；B. TPS-785-Ⅲ近红外荧光成像统工作原理；C. C57荷瘤小鼠活体近红外荧光成像图像；D. 4T1乳腺癌荷瘤小鼠离体组织器官近红外荧光成像图像

3 讨论

用于生物医学光学成像的理想激发和发射光谱应该具有较低的光散射、最低限度的组织吸收、可以忽略的自发荧光，疾病部位和正常部位之间能够获得良好的信噪比。近红外荧光包括传统的近红外1区(NIR-1：700～900 nm)及近红外2区(NIR-2：1000～1700 nm)源，由于组织光散射、光吸收及自发荧光显著低于其他波段光源，因此,具有更深的组织穿透能力以及更高的信噪比，能够实现更深层组织的光学成像，进而靶向识别并实时动态监测深部疾病部位并引导对疾病组织精确切除。

本课题组前期在国际上首次报道以IR-780为代表近红外七甲川花菁类荧光小分子探针，它们依赖于结构内在特性可被肿瘤细胞选择性摄取并蓄积于肿瘤细胞线粒体[14-15]。该类近红外荧光小分子在多种荷瘤动物模型中表现出良好肿瘤成像能力以及肿瘤光热、光动力和化学治疗活性。本文首次在结肠癌病人标本中探索了IR-780的肿瘤及淋巴结成像能力，结果发现IR-780能够特异性识别区分癌变组织及肿瘤细胞转移淋巴结。研究表明肿瘤细胞淋巴结转移是预测病理分期及病人预后的关键指标，因此，我们认为IR-780具有精确引导对恶性病变组织切除并最大限度保留正常组织以及肿瘤转移淋巴结清扫的能力，表现了较好临床转化应用的前景。

本文一方面利用法国的Fluobeam手术导航系统，评估了ICG对复杂创面的在体血管成像效果。通过糖尿病右足踇趾溃疡兼远端部分缺如患者及手部烧伤患者的损伤局部血管造影结果证实，基于ICG的近红外成像在复杂创面伤情评估中有较好的临床应用价值。另一方面，基于上述研究基础，我们协作开展对武汉华眸光电科技有限公司研制的近红外荧光成像系统评价研究，通过肿瘤特异性靶向的IR-780荧光探针小鼠体内实验。我们证实TPS-785-Ⅲ近红外成像系统具有稳定的近红外成像能力，且该成像系统高度集成便捷、成像速度快、成像视场大、空间分辨率高以及能同步采集可见光彩色图像与近红外荧光图像，表现出进一步开发前景。