温度对不同品种紫花苜蓿种子发芽特征的影响

向上，汪辉，田莉华，陈有军，孙万斌，周青平

(西南民族大学青藏高原研究院，成都 四川 610041)

紫花苜蓿(Medicagosativa)因其适口性好、品质优良、适应性广而在世界范围内被广泛种植。2018年，全球干草出口755万吨，其中，紫花苜蓿干草出口量最高，占55%[1]。随着我国振兴奶业苜蓿发展行动、粮改饲和草牧业政策的实施，紫花苜蓿种植规模迅速增长，紫花苜蓿在我国现代草地畜牧业生产和人工草地建植中发挥着重要作用。为满足种植需求，我国每年进口大量紫花苜蓿种子，2020年进口量为0.35万吨，同比增加37%[2]。相比国内培育的紫花苜蓿品种，引进的品种存在种植适应性差的风险。我国紫花苜蓿主要的栽培区域在北方，晚秋或早春播种时，低温是影响其萌发和出苗的主要因素之一。因此，了解主要栽培品种在低温下的发芽和幼苗生长特性对筛选紫花苜蓿适生品种及其推广种植具有一定的参考价值。

种子萌发是植物生命周期的起点，对种植环境十分敏感[3-4]，植物种子的萌发特性直接影响幼苗个体适合度和存活能力[5]。适宜的温度是植物种子萌发的必要条件，低温胁迫对种子萌发具有抑制作用。贾祥等[6]研究表明，在4 ℃低温胁迫下，紫花苜蓿、天蓝苜蓿、白花草木犀和黄花草木犀等4种豆科牧草的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚根长和胚芽长均低于对照(25 ℃)。高茜等[7]的研究也表明，相比25 ℃，紫花苜蓿种子在10 ℃下的发芽率显著降低，发芽时间延长，幼苗生长缓慢，植株较弱。低温主要通过影响种子生理活动，使其发芽率降低、使幼苗生长缓慢[8]。低温胁迫下，植物种子内活性氧(ROS)水平将会升高[9]，ROS的过量产生将会对植物的细胞和代谢功能产生危害，并对蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA造成损伤，进而导致膜损伤[10]，细胞呼吸减少[9]，从而导致细胞死亡[11]，最终致使种子发芽率降低，使产量严重受损[12]。

本研究以20个紫花苜蓿品种为试验材料，测定4、8和20 ℃下各品种的发芽指标，初步分析紫花苜蓿种子萌发特性对不同温度条件的响应，以期了解各品种的耐低温萌发特性，为筛选低温下适宜种植的紫花苜蓿品种，促进紫花苜蓿人工草地建植提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料包括金皇后、SG401、SG402、SG403、巨能418Q、巨能耐湿、巨能耐盐、4010、巨能CR、WL525、4020MF、亮牧、敖汉、草原3号、中草3号、中苜1号、中苜3号、肇东等20个紫花苜蓿品种(表1)。

表1 供试紫花苜蓿品种种子来源

1.2 试验设计

将20个紫花苜蓿品种种子分别放到20、8和4 ℃恒温培养箱中发芽，每个品种随机挑选100粒健康种子摆放到铺有2层滤纸的直径为12 cm的培养皿中，加入适量蒸馏水湿润滤纸，之后将培养皿移至恒温培养箱中，重复4次，并设置恒温培养箱的发芽环境为每天光照16 h，光照强度为600 mmol/(m2·s)，相对湿度为60%。每天补充水分，胚根突破种皮2 mm视为发芽。

1.3 指标测定

记录每天的发芽种子数，20和8 ℃于第10天结束发芽，4 ℃于第15天结束发芽，发芽结束时从每个重复中随机挑选10个种苗，测量苗长。按照以下公式计算相应指标：

(1)发芽势(%)=第4天时发芽种子总数/供试种子数×100%。

(2)发芽率(%)=发芽种子数/供试种子数×100%。

(3)发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)式中：Gt为第t日的出苗数；Dt为相应出苗天数。

(4)活力指数(VI)=GI×S；式中，S为平均芽长。

式中，ti为第i日出苗天数；ni为第i日出苗种子数；k为结束发芽时间。

(6)同步指数(the synchronization index，Z)

Z=∑Cni,2/N,Cni,2=ni(ni-1)/2N=∑ni(∑ni-1)/2，式中，ni为第i日出苗种子数。

1.4 数据分析

运用方差分析比较3个温度条件下20个紫花苜蓿品种的发芽率、发芽势、发芽指数、同步指数、平均发芽时间、活力指数、平均苗长，并采用最小显著差异法(LSD)对其进行多重比较。在计算各发芽指标相关性时为减少和消除紫花苜蓿种子初始指标间的差异性，选择相对萌发指标来评价。20 ℃下各指标值为1，4和8 ℃低温培养下的各指标值占20 ℃下相应指标值的比例即为相对指标值。运用简单相关分析法比较发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间、同步指数、平均苗长等7个萌发指标之间的相关性。

选取发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、苗长等5个指标对20个品种进行打分制综合评价[13]。以4、8 ℃低温处理下的指标值(T)占20 ℃测定的指标(CK)值的百分数(T/CK×100%)作为该指标的变化率。根据材料各个指标变化率的大小进行打分，打分的标准是把每一种指标的最大变化率与最小变化率之间的差值均分为10个级别，每级分别赋予不同的得分，即1分、2分……、10分。各个指标均以抗寒性最强的品种得分最高，即10分，抗寒性最弱的品种得分最低，即1分，依此类推。最后把各个指标的得分进行相加得到试验材料萌发期的抗寒性总分，根据各品种苗期的抗寒性总分可得到抗寒性排序。

方差分析、相关分析均用SPSS 21.0软件辅助完成，使用Origin完成制图。

2 结果与分析

2.1 温度对紫花苜蓿种子发芽指标的影响

2.1.1 发芽种子数 20 ℃下，各紫花苜蓿品种均在第1天开始发芽，第3天时各品种发芽种子数皆达到50个以上，第4天后各品种发芽种子数恒定(图1-A)。8 ℃下，第3天时，SG403等品种开始发芽，至发芽结束各品种发芽种子数缓慢增加(图1-B)。4 ℃下，第6天时，仅有亮牧、巨能耐盐、金皇后等部分品种开始发芽；第10天时，巨能耐湿等12个品种发芽的种子数小于5个(图1-C)。

图1 20个品种紫花苜蓿种子的发芽过程

2.1.2 发芽势 20 ℃时，SG403发芽势最高，达97%，与龙牧806、龙牧801、SG402、WL525、SG401、4010、巨能418Q、肇东之间差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；草原3号发芽势最低，为71%(表2)。8 ℃时，同样，SG403发芽势最高，为43%，与巨能418Q、亮牧、4020MF、巨能耐盐、SG402差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；4010发芽势最低，只有1%(表2)。而4 ℃时的发芽势，除了巨能耐盐发芽势为10%以外，几乎都为0(表2)。

同一品种在不同温度下的发芽势存在差异，所有参试品种在20 ℃时的发芽势均显著(P<0.05)高于8和4 ℃时；且除了4010、龙牧806、龙牧801草原3号以外，其余品种在8 ℃的发芽势均显著(P<0.05)高于4 ℃时。

2.1.3 发芽率 20 ℃时，龙牧806发芽率最高，达到100%，与肇东、龙牧801、SG402、4010、SG403、SG401、WL525差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；草原3号20 ℃发芽率最低，为72%(表2)。8 ℃时，巨能418Q发芽率最高，达92%，与SG403、巨能耐湿、中苜3号、亮牧、SG402、WL525、肇东差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；龙牧806在8 ℃发芽率为最低，为40%(表2)。4 ℃时，SG402发芽率最高，达65%，与巨能耐盐、4020MF、亮牧、SG401之间差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；龙牧806在4 ℃时发芽率最低，为4%(表2)。

同一品种在不同温度下的发芽率存在差异，除中苜3号、巨能耐湿、巨能418Q、SG402、龙牧801、WL525、4020MF、肇东以外，其余参试品种皆是在20 ℃时的发芽率显著(P<0.05)高于8 ℃和4 ℃；8 ℃时的所有品种发芽率都显著(P<0.05)高于4 ℃。

2.1.4 发芽指数 20 ℃时，WL525发芽指数最高，达267.82，显著(P<0.05)高于其余品种；草原3号发芽指数最低，为144.25(表2)。8 ℃时，SG403发芽指数最高，达86.10，与巨能418Q差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；龙牧806发芽指数最低，达21.29。4 ℃时，巨能耐盐发芽指数最高，达45.96，与4020MF、SG402差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；龙牧806发芽指数为最低，为0.47。

除了金皇后在8 ℃与4 ℃条件下的发芽指数之间不存在显著差异，其余各品种在20 ℃时的发芽指数均最高，在4 ℃时均最低，不同温度间差异显著(P<0.05)。

2.1.5 活力指数 20 ℃时,WL525活力指数最高，达688.54，与肇东、龙牧806、龙牧801差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；草原3号活力指数最低，为227.21(表2)。8 ℃时，巨能418Q活力指数最高，达89.91，与SG403、SG402差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；龙牧806活力指数最低，为12.10(表2)。4 ℃时，巨能耐盐活力指数最高，达39.10，显著(P<0.05)高于其余参试品种；龙牧806活力指数最低，为0.23(表2)。

表2 紫花苜蓿各品种发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数

20个品种在20 ℃时的活力指数，均显著(P<0.05)高于8 ℃和4 ℃；巨能CR、巨能418Q、巨能耐湿、中苜1号、亮牧等5个品种在4 ℃时的活力指数，均显著(P<0.05)低于8 ℃时，其余品种4和8 ℃时的活力指数之间差异不显著。

20 ℃时各品种活力指数为688.54～277.21，8 ℃时各品种活力指数的变幅为89.91～12.10，4 ℃时各品种活力指数为39.10～0.23，且20 ℃时的活力指数均值为429.32，8 ℃时的活力指数均值为49.09，4 ℃时的活力指数均值为0.23。

2.1.6 苗长 20 ℃时，龙牧806的苗长最大，为3.17 cm，与龙牧801差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；中苜1号苗长最小，为1.39 cm，各品种的平均苗长为1.9 cm(表3)。8 ℃时，巨能418Q的苗长最大，为1.10 cm，与巨能CR、SG403、巨能耐湿、中苜3号、SG402差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余品种；草原3号苗长最小，为0.56 cm，各品种的平均苗长为0.86 cm。4 ℃时，巨能耐盐的苗长最大，为0.85 cm，与金皇后，SG401、亮牧、4020MF、SG402、差异不显著，但显著(P<0.05)高于其余参试品种；中苜1号苗长最短，达0.23 cm，各品种的平均苗长为0.47 cm。20 ℃下各品种的苗长均显著(P<0.05)高于8和4 ℃。

2.1.7 平均发芽时间 20 ℃时，WL525平均发芽时间最短，为5.55 d，显著(P<0.05)低于其余品种，中苜3号平均发芽时间最长，o 6.02 d(表3)；8 ℃时，SG403平均发芽时间最短，为7.21 d，与SG402、巨能418Q、巨能耐盐、巨能CR、4020MF、中苜1号、肇东差异不显著，但显著(P<0.05)低于其余品种，4010平均发芽时间最长，为8.25 d(表3)。4 ℃时，龙牧801平均发芽时间最短，为10.09 d，与SG401、SG402、SG403、金皇后等12个品种差异不显著，但显著(P<0.05)低于其余品种，中苜1号发芽时间最长，为13.51 d(表3)。

表3 紫花苜蓿各品种苗长、平均发芽时间和同步指数

随着温度的降低，20个紫花苜蓿品种的平均发芽时间均显著(P<0.05)增加，20 ℃时的平均发芽时间最短，4 ℃最长，3个温度间差异显著(P<0.05)。相对于20 ℃，8 ℃时的平均发芽时间增加了32%，4 ℃时的平均发芽时间增加了109%。

2.1.8 同步指数 20 ℃时，WL525同步指数最低，为0.0991，与巨能418Q、巨能CR、4010、巨能耐湿等8个品种差异不显著(P>0.05)，但显著(P<0.05)低于其余参试品种，SG402同步指数最高，达0.1057(表3)。8 ℃时，SG403同步指数最低，为0.1408，与SG402、巨能418Q、巨能耐湿、巨能耐盐等10个品种差异不显著，但显著(P<0.05)低于其余参试品种，4010同步指数最高，达0.1973(表3)。4 ℃时，龙牧801同步指数最低，为0.0521，与肇东、中草3号等5个品种差异不显著，但显著低于其余参试品种，巨能418Q同步指数最高，达0.2116(表3)。

同一品种在不同温度下的同步指数存在差异，20与8 ℃条件下除肇东与龙牧806差异不显著，其余参试品种均差异显著(P<0.05)；金皇后、中草3号、4020MF、巨能耐盐等4个品种在8 ℃时的同步指数显著高于20和4 ℃，且20和4 ℃的同步指数差异不显著。

2.2 相关性分析

8 ℃时，除相对发芽势与相对苗长显著(P<0.05)相关外，其余各指标之间均极显著(P<0.01)相关(表4)，其中，相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数、相对苗长等5个指标间均呈极显著(P<0.05)正相关，并与相对发芽时间和相对同步指数呈极显著(P<0.01)负相关。4 ℃时，相对发芽率、相对发芽指数、相对活力指数、相对苗长之间呈极显著(P<0.01)正相关，并与相对发芽时间呈显著(P<0.05)负相关。相对发芽势与相对发芽指数、相对活力指数呈显著正相关(P<0.05)，与相对平均发芽时间呈显著负相关(P<0.05)。

表4 各相对发芽指标相关分析

2.3 紫花苜蓿发芽期抗寒性综合评价

根据发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间、苗长等6个发芽指标综合评价各紫花苜蓿品种在低温下的发芽表现。8 ℃时，巨能418Q、SG403、巨能耐湿、中苜3号、4020MF、SG402等6个品种的总得分为50以上(表5)。4 ℃时，巨能耐盐得分最高，为57分(表6)。

表5 8 ℃下各紫花苜蓿品种抗寒性综合评价

表6 4 ℃下各紫花苜蓿品种牧草抗寒性综合评价

3 讨论

低温作为一种主要的环境胁迫因子，不仅限制植物地理分布，而且严重影响植物生长发育和农作物产量。本研究结果表明，紫花苜蓿种子萌发期的活力随着温度的降低而降低，其表现为各紫花苜蓿品种的发芽率、发芽指数、活力指数的降低以及苗长的缩短；同时，其萌发一致性也随着温度的降低而降低，表现为发芽势降低，发芽时间延长。萌发期种子活力以及发芽一致性的降低可能是因为低温打破了原有的代谢平衡，破坏生物体酶系统，使植物体内代谢紊乱，有毒物质累积，从而影响植物生长发育[14]。

低温胁迫显著延长种子萌发时间。本试验结果表明，在20、8、4 ℃下，多数紫花苜蓿品种分别在第1、3、7天开始萌发。这可能是因为低温会降低种子的吸水速率，从而导致吸水后的种子代谢速率减慢，甚至扰乱代谢修复，影响有机物代谢与运输，降低与种子萌发相关的酶活性，造成吸胀冷害，使胚根突出时间延长，最终导致发芽迟缓[15-18]。且有研究表明，温度的变化会影响植物对水分和养分的吸收[19-20]，间接影响植物的生长和生物量的积累[21]。

以往研究表明，15～25 ℃为紫花苜蓿最佳发芽温度[22-24]。Twain等[22]在研究温度对豆科植物发芽影响时指出，大豆等暖季型植物最适发芽温度为25 ℃，紫花苜蓿等冷季型植物的最适发芽温度为20 ℃。沈忱等[23]研究6个紫花苜蓿品种在5～40 ℃下的发芽表现时，得到，5～25 ℃时，各品种均具有较高的发芽率，在25 ℃时发芽速率均显著高于其他温度；30 ℃时，各品种发芽率开始降低，胚根长度显著变短。本研究中，相比4和8 ℃，20个紫花苜蓿品种在20 ℃的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、苗长等发芽活力特征上均表现了显著的优势。

作物通过多种代谢途径应答低温胁迫，表现出复杂的耐寒机理，应综合考虑多种指标对耐寒性的作用，即选取多个指标共同评价作物耐低温性，以合理有效地区分不同基因型间的耐低温性。关于作物耐寒性的评价方法很多，常用的有聚类分析、主成分分析、灰色关联度、平均隶属函数法等[25]。在评价植物其他抗逆性表现时，打分法也是一种综合评价方法。吐尔逊娜依等[13]选取活力指数、质膜相对透性、丙二醛含量、相对生长速度以及相对含水量5种指标对8种牧草的耐盐性进行打分；吕亚慈等[26]则选取发芽率、发芽指数、活力指数、根长、苗长5个指标对6种燕麦耐盐性进行打分；罗志娜等[27]使用发芽率、发芽势、根长和苗长等4个指标对24个燕麦品种的耐盐性进行评价。本研究中，相关性分析表明，发芽率、发芽指数、活力指数、苗长等指标两两之间均极显著(P<0.01)正相关，发芽势与以上4个指标均极显著(P<0.01)正相关，低温胁迫下的发芽时间与代表种子活力的4个指标以及发芽势之间均显著(P<0.05)负相关，这说明种子萌发活力与发芽一致性之间存在一定的联系。本研究采用打分法对紫花苜蓿在低温下的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间、苗长等6个发芽指标综合评价各紫花苜蓿品种在低温下的发芽表现，得出巨能418Q、SG403、巨能耐湿、中苜3号、4020MF、SG402和巨能耐盐等品种在低温下的发芽表现较好。

4 结论

本研究结果表明，随着温度的降低，紫花苜蓿的发芽活力以及发芽一致性均逐渐降低，表现为不同品种紫花苜蓿的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、苗长的降低以及平均发芽时间的延长。在我国北方播种紫花苜蓿时，气温较低的区域可考虑巨能418Q、SG403、巨能耐湿、中苜3号、4020MF、SG402以及巨能耐盐等7个品种。