亚致死剂量三唑锡对二斑叶螨Tetranychus urticus解毒酶系的影响

叶调琴，杨顺义，李文平

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

二斑叶螨(Tetranychusurticae)是一种世界性的农牧业害螨，为害多种作物，如苜蓿、三叶草等。二斑叶螨的成、若螨群集于植物叶背刺吸汁液，受害叶片呈白色失绿斑点，严重时枯死。二斑叶螨有体型小，繁殖快，世代短，分布广和突变率高等特点，加之不合理的使用化学农药，使其对多种药剂产生了抗药性，给现代农业生产造成了严重损失[1-2]。

在甘肃地区二斑叶螨主要危害果树、蔬菜、农作物及牧草，且危害范围有扩大的趋势。梁旭东[3]研究发现兰州市二斑叶螨中度为害。张廷伟等[4]研究发现二斑叶螨3个不同虫口密度下白三叶体内叶绿素含量、POD、PPO活性差异显著(P<0.05)。

三唑锡，化学名称为1-(三环已基甲锡烷基)-1氢-1,2,4-三氮杂茂，是一种广谱的有机锡类杀螨剂，广泛用于防治果树、蔬菜和花卉上发生的害螨，对柑橘红蜘蛛(Panonychuscitri)、苹果全爪螨(P.ulmi)二斑叶螨的防治效果显著，对抗有机磷农药的螨类有较好的防治效果，可杀灭若螨及成螨，对夏卵也有一定杀灭效果[5-6]。刘敏等[7]研究发现三唑锡亚致死浓度与土耳其斯坦叶螨(T.turkestani)运动速率成反比。安晓宁等[8]研究发现20%三唑锡悬浮剂对苹果红蜘蛛防效好且对苹果树安全。于士将等[9]研究发现20%四螨嗪·三唑锡悬浮剂对柑桔全爪螨(P.citri)防效较好且对柑桔和天敌安全。

螨类抗药性的形成与其代谢作用及靶标部位的敏感性密切相关。螨类主要通过调节体内谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和多功能氧化酶(MFOs)等解毒酶表达量或活性的增加，来提高对药剂的解毒能力[10]。目前，已有大量研究表明叶螨对多种农药产生抗性，包括神经毒素类(如有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类)、线粒体电子传递链抑制剂类(哒螨灵)等[11-12]。但三唑锡对叶螨的抗药性研究报道较少。本文研究了三唑锡亚致死剂量LC10和LC30处理下二斑叶螨体内3种解毒酶(CarEs、GSTs和MFOs)酶比活性的变化情况，旨在为深入研究二斑叶螨的抗药性机制及三唑锡的合理使用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 二斑叶螨敏感品系由甘肃农业大学植物保护学院农药学实验室提供，在室温(25±1)℃，相对湿度(70±5)%条件下，用新鲜、干净的豇豆叶片饲养，期间不接触任何药剂，连续繁殖，取雌成螨作供试虫源。

1.1.2 供试药剂 20%三唑锡悬浮剂(陕西标正作物科学有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 室内毒力测定及亚致死剂量确立 毒力测定：室内毒力测定参照FAO(1980)推荐的玻片浸渍法[16](slide-dip method)并加以改进。取1 cm宽的双面胶带剪成1.5 cm长，贴在载玻片的一端，用镊子揭去双面胶上的纸片，再用零号毛笔挑取行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(不能粘住螨足、螨须和口器)，每片粘35头，分成3行。在温度(25±1)℃，相对湿度为(70±5)%的智能人工气候箱中放置1 h后，用双目镜观察，去除死亡和不活泼个体，保留30头。移取1 mL 20%三唑锡悬浮剂，分别加水稀释为1、0.66、0.5、0.4、0.33 mg/L等5个浓度，将带螨载玻片一端浸入药液中，轻轻摇动5 s后取出，用滤纸吸干螨体周围多余的药液，放入铺有海绵的托盘中，置于温度(25±1)℃、光周期L∶D=16 h∶8 h、相对湿度为(70±5)%的智能人工气候箱，24 h后检查结果，用笔尖轻触螨体，以螨足不动者为死亡；试验重复3次，以无菌室作为对照，计算出毒力回归方程，得出LC10与LC30值。

1.2.2 解毒酶系酶液制备 供试螨处理 根据室内毒力测定结果，以LC10和LC30浓度，采用叶片喷雾法处理二斑叶螨雌成螨，每处理设3个重复，以无菌水作对照[14]。喷药后放置于温度为(25±1)℃，相对湿度(70±5)%，光周期16 h∶8 h的条件下饲养。将喷药后的雌成螨分别于3、6、12、24、48 h，每个时间段各挑取100头活螨置于干净的1.5 mL离心管中，放置4 ℃冰箱下保存待用。

解毒酶系酶液制备 用零号毛笔分别挑取三唑锡药剂处理和无菌水处理后的二斑叶螨雌成螨100头，置于3个1.5 mL离心管中，于4 ℃冰箱冰冻24 h，再分别加入0.04 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液、66 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液和0.1 mol/L pH 7.8磷酸缓冲液1.5 mL，用研磨棒于冰水浴中研磨，在10 000 r/min，4 ℃下离心15 min，取上清液备用。

酶源蛋白含量及解毒酶系酶比活性测定：牛血清蛋白、α-萘酚和对硝基苯酚标准曲线制作：参照何恒果[15]的方法。酶源蛋白含量测定：参考Bradford[16]的方法。羧酸酯酶(CarEs)活性测定参考Van Asperen[17]方法；谷胱甘肽转移酶(GSTs)活性测定参考Clark等[18]方法；多功能氧化酶(MFOs)活性测定参考Hansen和Hodgson[19]方法。

1.3 数据处理

运用新复极差法(Duncan’s)分析各处理间酶比活力差异显著性。

2 结果与分析

2.1 三唑锡毒力测定结果

三唑锡毒力回归方程为y=3.959x+1.882，卡方值x2=4.589，相关系数R=0.928，LC50值为0.335 mg/L，LC10值为0.159 mg/L，LC30值为0.247 mg/L。

2.2 亚致死剂量三唑锡对二斑叶螨解毒酶比活性的影响

2.2.1 亚致死剂量三唑锡对GSTs酶比活性的影响 三唑锡亚致死剂量LC10处理二斑叶螨后，其体内的GSTs在3～6 h和12～24 h酶比活性逐渐升高，6 h达到最高，其余时间段酶比活性下降，整体明显高于对照；LC30剂量处理后，变化规律与LC10相似，除24 h酶比活性低于LC10外，其余时间段GSTs活力缓慢升高，在6 h和48 h时达到最大，处理6～12 h酶比活性下降，12 h时达到最低，但酶比活性整体高于对照和LC10(图1)。

图1 三唑锡亚致死剂量处理下二斑叶螨体内GSTs酶比活性的变化

2.2.2 三唑锡亚致死剂量对CarEs酶比活性的影响 二斑叶螨CarEs酶比活性在LC10剂量下，总体呈上升趋势，6～12 h酶比活性降低，其余时间段内均逐渐增加，至48 h时达到最大，除3 h时低于对照外，其余均高于对照。LC30剂量下整体呈上升趋势，12～24 h酶比活性降低，其余时间段内均逐渐增加，至48 h时达到最大，明显高于对照和LC10(图2)。

图2 亚致死剂量三唑锡处理下二斑叶螨体内CarEs酶比活性

2.2.3 三唑锡亚致死剂量对MFOs比活力的影响 二斑叶螨MFOs活力在LC10剂量下总体呈缓慢上升趋势，在6～12 h和24～48 h升高，至48 h时达最大，除3和24 h时低于对照外，其余时间段内均高于对照；在LC30剂量下整体呈下降趋势，其中在3～6 h时上升较快，而后下降，在6 h时达到最大，除48 h时外，其余时间酶活均高于LC10，且各时间点间差异不显著。

3 讨论

化学药剂杀虫是防治害虫的最普遍的措施。杀虫剂除了直接杀灭害虫外，残存于环境中的有效成分也会随着时间的推移降解至亚致死浓度，引起亚致死效应[20]。亚致死剂量杀虫剂不仅对昆虫生长发育、繁殖力及抗性等有影响，也会对其体内多种解毒代谢酶产生诱导或抑制作用[24-25]。而亚致死效应作为预测害虫种群发生动态和害虫抗药性监测的重要手段，其研究主要为体内的解毒酶(主要是GSTs、CarEs和MFOs)的比活力变化。

图3 亚致死剂量三唑锡处理下二斑叶螨体内MFOs比活性

本试验研究了三唑锡亚致死剂量处理二斑叶螨后，谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶的酶比活性在不同时间点的变化。用LC30和LC10处理二斑叶螨后，其体内3种解毒酶LC30处理均高于LC10处理且明显高于对照组，表明随着时间的变化药剂浓度越高酶比活性越高，说明三唑锡对3种解毒酶有抑制作用且浓度越高抑制作用越明显。这与前人报道的研究结果一致，如常芸等[23]通过二斑叶螨经乙唑螨腈和联苯肼酯亚致死剂量(LC10、LC30)处理后，其体内GSTs的酶比活性除乙唑螨腈LC10处理在12 h和24 h、联苯肼酯LC10处理在24 h时表现为抑制作用外，其余时间段均较对照高，表现为激活作用。金晶等[24]研究在亚致死剂量苦参碱处理后，二斑叶螨体内解毒酶比活性会随时间发生改变，但整体上，3大解毒酶的比活性较对照都有所增加。李瑞娟等[25]研究梅岭霉素和溴虫腈对二斑叶螨的抗性机理的影响发现在处理6 h后溴虫腈对MFO酶活力诱导显著，并且随时间的增长酶活力增强，但在处理24～48 h处理组与对照组相比无显著差异。由此得出二斑叶螨对溴虫腈的代谢与MFO有关。杨娟生等[26]研究发现致死剂量溴虫腈和毒死蜱亚处理等钳蠊螨(Blattisociusdentriticus)24 h后、GST细胞色素P450、CarE的酶比活性较对照高且P450的酶比活性明显高于对照。

综上所述，本试验结果可为研究二斑叶螨的抗药性机制及三唑锡的合理使用提供前期理论依据。但试验仅测定了解毒酶比活性，继续探讨二斑叶螨对三唑锡的抗性需进行更深入的研究。

4 结论

本试验经过三唑锡处理二斑叶螨后，发现其体内GSTs酶比活性在LC30剂量下均高于LC10(除24 h外)和对照。CarEs酶比活性在LC30剂量下均高于LC10和对照。MFOs酶比活性在LC30剂量均高于LC10和对照；LC10剂量处理与LC30剂量处理相一致，均高于对照。说明3种解毒酶的酶比活性的变化与三唑锡的抗性有关。