多粘类芽孢杆菌纤维素酶基因bglA，bglB和EG在乳酸菌中的分泌表达

刘原子，王 艳，万学瑞，王 川，吴 润，刘 岗，吴自祥

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)

多粘类芽孢杆菌纤维素酶基因bglA，bglB和EG在乳酸菌中的分泌表达

刘原子，王 艳，万学瑞，王 川，吴 润，刘 岗，吴自祥

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)

通过PCR扩增获得乳酸菌(LactobacteriumlactisMG1363)的usp45基因，将其克隆到乳酸菌(L.lactis)食品级表达载体pNZ8048中获得分泌型表达载体pNZ-X；然后将多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因EG分别连接载体pNZ-X，获得重组质粒pNZ-X::bglA，pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG，将3个质粒电转导入L.lactisNZ9000，得到重组乳酸菌L.lactisNZ9000/pNZ-X::bglA、L.lactisNZ9000/pNZ-X::bglB和L.lactisNZ9000/pNZ-X::EG，并测定分泌性表达的BglA，BglB和EG的酶活性。结果显示：3个酶大小均在50 kU；DNS法测定酶活力表明重组菌株的酶活力显著低于多粘类芽孢杆菌的酶活力(P<0.05)，但具有一定的活性；刚果红染色结果也表明重组乳酸菌分泌产生的酶可产生明显的水解圈。试验为重组纤维素酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案，为秸秆的降解研究奠定了基础。

乳酸菌；纤维素酶；多粘类芽孢杆菌；分泌型表达；酶活测定

纤维素作为环境友好的可再生能源，因其特殊的结构并未得到很好的开发与利用，在我国农村秸秆主要被焚烧，浪费资源且污染环境，只有很少的一部分被作为饲料利用。目前，纤维素的降解包括物理法、化学法和生物降解法，其中，生物降解法是将纤维素彻底分解而又无污染的有效途径[1]。纤维素酶在秸秆青贮中的应用主要是将纤维素酶食品级菌株添加到饲料中进行青贮，不仅为饲料工业节省大量的人力财力[2]，而且可补充草食动物内源酶的不足，有消除抗营养因子，提高畜禽生产性能，降低致病微生物的黏附和定植等功能。因此，纤维素酶作为饲料添加剂已成为人们研究的热点。目前，产纤维素酶的微生物有细菌、真菌、放线菌等，细菌主要有芽孢杆菌等，真菌有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等，放线菌主要有玫瑰色放线菌(Actinomycesroseodiastaticus)和纤维放线菌(Actinomycescellulose)等[3]。

常见的纤维素酶的表达系统有大肠杆菌[4]、乳酸发酵短杆菌[5]和酿酒酵母等[6-7]。乳酸菌(LAB)作为安全的食品级微生物，是一类可发酵糖产生乳酸的革兰氏阳性菌的总称，在过去20年里，乳酸菌在基因工程的发展与分子生物学研究方面已经取得了显著的进步[8]，其nisin诱导基因表达系统因其诱导剂、筛选物和宿主菌株均为食品级，符合FDA安全标准，因此，乳酸菌是应用最广的异源蛋白表达系统[9-11]，而且这些食品级的细菌不产生脂多糖或其他毒素，不形成包涵体，重组产物也不需要纯化[8,12]。

有研究报道多粘类芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶对木质纤维素来源的纤维二糖的水解有较高专一性[13]。选择实验室分离的来源于西北特殊地理环境的一株多粘类芽孢杆菌作为研究材料，以便实现纤维素酶基因在乳酸菌中的分泌型重组表达，为提高饲料转化率，补充草食动物内源酶和提高畜禽生产性能奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌DH5α、质粒pBluescript ⅡKS(+)为实验室保存，多粘类芽孢杆菌(内切β-葡聚糖酶的酶活力高达254.144 U/mL)为本实验室分离所得，质粒pNZ8048、乳酸杆菌L.lactisNZ9000和L.lactisMG1363由中国科学院微生物研究所钟瑾研究员馈赠。

1.1.2 试剂 限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ、Hind Ⅲ、EcoRⅤ和pMD18-T购于TaKaRa公司；T4 DNA Ligase购于Thermo fisher公司；nisin(乳酸链球菌素)购于Sigma公司；氨苄青霉素、氯霉素、Easy Taq supermix、FastPfu fly DNA Polymerase购于北京全式金生物技术有限公司；刚果红、3，5-二硝基水杨酸、水杨苷、CMC-Na购于国产分析纯；CTAB、酵母提取物和蛋白胨购于OXOID公司产品；质粒DNA小提试剂盒、胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司；BCA试剂盒购于biomiga公司。

1.1.3 培养基 培养大肠杆菌DH5α及多粘类芽孢杆菌的培养基为LB培养基[14]，LB-微晶纤维素钠培养基用于多粘类芽孢杆菌的诱导，LB-CMC培养基用于刚果红染色[15]，GM17培养基用于L.lactisNZ9000及L.lactisMG1363的培养[16]。使用氨苄青霉素筛选质粒的终浓度为100 μg/mL，氯霉素终浓度为10 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 多粘类芽孢杆菌在LB液体培养基中37℃震荡培养过夜，将菌体收集后通过CTAB法提取基因组DNA[17]；乳酸菌L.lactisMG1363在GM17液体培养基中30℃静置培养过夜，将菌体收集后也通过CTAB法提取基因组DNA。

1.2.2 分泌型表达载体pNZ-X的构建 以乳酸菌L.lactisMG1363基因组DNA为模板，根据GenBank公布的L.lactisMG1363的usp45基因序列设计P1/P2引物(表1)PCR扩增usp45片段，使用北京全式金生物技术有限公司的EasyTaq supermix进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸5 min。用胶回收试剂盒回收PCR产物后，与pMD18-T连接并转化E.coliDH5α。经菌液PCR扩增及双酶切验证后，将正确的质粒和pNZ8048同时经NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切，将酶切产物分别胶回收后，通过T4 DNA Ligase连接，转化E.coliDH5α，在含氯霉素抗性的LB平板上挑选阳性菌，经菌液PCR和双酶切验证正确后将得到的分泌型表达载体pNZ-X送往金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.3 分泌型表达载体pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG的构建 以多粘类芽孢杆菌基因组DNA为模板，使用北京全式金生物技术有限公司的FastPfu fly DNA Polymerase进行扩增，bglA-F/R为引物(表1)进行PCR扩增bglA片段，bglB-F/R为引物进行PCR扩增bglB片段，bglA和bglB的PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min 40 s，共30个循环；72℃延伸10 min；以多粘类芽孢杆菌基因组DNA为模板，内5-F/R为引物(表1)进行PCR扩增EG片段，PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min 40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。将纯化后的PCR产物与经过EcoRⅤ酶切的pBluescript ⅡKS(+)通过T4 DNA Ligase连接，将连接产物转化E.coliDH5α，经菌液PCR和双酶切验证后得到重组质粒pBluescript ⅡKS(+)::bglA、pBluescript ⅡKS(+)::bglB、pBluescript ⅡKS(+)::EG。

将重组质粒pBluescript ⅡKS(+)::bglA、pBluescript ⅡKS(+)::bglB、pBluescript ⅡKS(+)::EG和载体pNZ-X同时经XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切，酶切产物分别胶回收后，通过T4 DNA Ligase将载体pNZ-X与片段bglA，bglB和EG分别连接，并将连接产物转化E.coliDH5α，获得重组质粒pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG，经菌液PCR扩增和双酶切鉴定后，将这三个重组质粒送往金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.4 质粒电击转化乳酸菌L.lactisNZ9000及诱导表达L.lactisNZ9000感受态细胞的制备及电击转化参考文献[18-19]，用Bio-Rad 电转仪(Gene Pulser Xcell 617BR1 06692)电击，电击条件为：1200 V，100 Ω，25 μF，电击转化后将复苏菌涂在含氯霉素抗性的GM17培养基上筛选阳性菌落，30℃培养24 h后挑取单个菌落接种于新鲜含氯霉素的GM17培养基，30℃培养至D600 nm为0.6，加入nisin至终浓度为10 ng/mL诱导表达，48 h后取上清液用镍柱进行纯化，并通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况[20]。

1.2.5 重组纤维素酶的定量分析和酶活力的测定 通过BCA试剂盒绘制562 nm下的蛋白浓度标准曲线，并测定样品的D562 nm值，通过标准曲线，计算样品的总蛋白浓度。

通过DNS法测定BglA，BglB和EG酶活[21]。酶活定义为每分钟内分解底物生成1 μg葡萄糖所需酶量定义为1个酶活单位，以U/mL表示。平行试验重复3次，并使用SPSS软件进行显著性差异分析。

将LB-CMC培养基进行刚果红染色，并根据水解圈的大小判断水解活性。

表1 纤维素酶基因扩增引物

2 结果与分析

2.1 分泌型表达载体pNZ-X、pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB及pNZ-X::EG的构建

usp45基因经PCR扩增后检测，所得产物片段大小为80 bp，将其连接pMD18-T载体后经双酶切检测，分别在3 000 bp和80 bp出现条带。将正确的克隆子以NcoⅠ、Hind Ⅲ酶切后，胶回收小片段，与同样酶切的pNZ8048连接，转化E.coliDH5α，获得重组质粒pNZ-X，经双酶切后，分别在3 500 bp和80 bp出现相应条带，测序结果与GenBank上公布的usp45序列(GenBank登录号EU382094.1)完全一致，表明分泌型表达载体pNZ-X构建成功。

将正确的质粒pBluescript ⅡKS(+)::bglA、pBluescript ⅡKS(+)::bglB及pBluescript ⅡKS(+)::EG以XbaⅠ、Hind Ⅲ酶切后，与同样酶切的pNZ-X质粒连接，转化E.coliDH5α。重组质粒通过双酶切验证分别在3 500 bp和1 500 bp位置有相应的条带，测序结果与GenBank上公布的序列(bglAGenBank登录号M60210.1，bglBGenBank登录号M60211.1，EGGenBank登录号AB695293.1)完全一致，说明分泌型表达载体pNZ-X::bglA、 pNZ-X::bglB及pNZ-X::EG构建成功。

图1 重组质粒双酶切验证Fig.1 Recombinant plasmid digested注：M.DNA marker；1.pMD18-T::usp45重组质粒双酶切；2.pNZ-X::bglA重组质粒双酶切；3.pNZ-X::bglB重组质粒双酶切；4.pNZ-X::EG重组质粒双酶切；5.pNZ::X重组质粒双酶切；6.pNZ8048质粒.

2.2 质粒pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB及pNZ-X::EG转化乳酸菌

分别提取质粒pNZ-X::bglA,pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG，电转化L.lactisNZ9000，涂在含氯霉素抗性的GM17平板上，得到多个克隆子。克隆子经过PCR扩增鉴定，分别含有质粒pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB及pNZ-X::EG，表明乳酸菌分泌型表达系统构建成功。

图2 SDS-PAGE电泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis注：M.蛋白；1.BglA诱导前；2.BglB诱导前；3.EG诱导前；4.BglA诱导后；5.BglB诱导后；6.EG诱导后；7.BglA纯化后；8.BglB纯化后；9.EG纯化后

2.3 重组蛋白的表达及SDS-PAGE电泳

将测序正确的质粒电转乳酸菌NZ9000感受态细胞，用nisin诱导表达后，提取蛋白样品进行SDS-PAGE分析(图2)，结果表明，BglA，BglB和EG在诱导前没有特异性的条带，在诱导后出现了特异性条带，纯化后只有单一的条带，诱导后的BglA，BglB和EG蛋白在50Ku处有明显的蛋白表达带，与文献中报道的多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymy)所产β-葡萄糖苷酶分子量为50 Ku相符[22]，EG与BglA，BglB的片段大小一致，因此在相同位置出现蛋白条带。

2.4 DNS法测定重组菌株酶活力

用DNS法测定重组β-葡萄糖苷酶酶活力值(表2)。通过SPSS软件分别比较多粘类芽孢杆菌与BglA、BglB、EG的酶活值。多粘类芽孢杆菌的酶活力为(4.134±0.216) U/mL，BglA的酶活力为(2.174±0.305)U/mL，BglB酶活力为(1.933±0.268)U/mL， EG的酶活力为(2.427±0.558)U/mL，BglA、BglB、EG与多粘类芽孢杆菌的酶活力值差异显著(P<0.05)，显著低于多粘类芽孢杆菌的酶活值。

表2 DNS法测定酶活力值

注：*表示差异显著(P<0.05)，#表示差异不显著(P>0.05)

2.5 刚果红染色

图3 刚果红染色水解圈Fig.3 Congo red stain hydrolysis circle注：1.多粘类芽孢杆菌；2.EG上清；3.BglA上清；4.BglB上清；5.BglA纯化后；6.BglB纯化后；7.EG纯化后

将样品按顺序加入CMC-Na的LB平板孔中，37℃过夜培养，经刚果红染色、NaCl溶液脱色后出现水解圈，根据水解圈直径的大小即可判断水解活性的强弱。多粘类芽孢杆菌的水解圈直径最大，酶活最强。BglA，BglB和EG上清液加入刚果红染色平板中出现水解圈，说明上清液中存在蛋白，分泌型表达载体构建成功，并且上清液的水解圈大于纯化后的水解圈，是由于纯化后去除了杂蛋白。

3 讨论

研究表明反刍动物粪便中有20%～70%的纤维素可被检出[23]，在草食动物体内纤维素的转化率并不高，大部分的纤维素都被动物体直接排出，没有被动物利用，因此，通过青贮提高秸秆饲料营养、提高反刍动物对青贮饲料中的纤维素利用非常重要。目前，纤维素酶的表达主要是在大肠杆菌中，也有在酵母[1,4]、枯草芽孢杆菌[24]、丝状真菌[1,3]中表达的。卢敏等[25]及我们以前构建的纤维素酶表达工程菌多连接pET表达载体，并在大肠杆菌中诱导表达，其表达量均不是很高。赵云等[26]将多粘类芽孢杆菌(bacilluspolymyxa)β-葡萄糖苷酶基因克隆到pET-28a上，并在E.coliBL21中表达，粗酶液酶活为24.7 I U/mL；任大明等[27]将绿色木霉纤维素酶CBHⅠ基因克隆到 pET-28a上，并在E.coliBL21中表达，重组酶活力为5.3 U/mg。

由于乳酸菌对人体安全，分泌型载体表达外源基因不利于形成二硫键，使表达产物能够正确折叠，并且周质空间的蛋白酶水解活性较低，分泌到此的蛋白更加稳定[28]。乳酸菌表达系统L.lactisNZ9000是食品级安全表达系统，可通过nisin的诱导作用，大幅度提高外源基因的表达效率，因此很多基因已在乳酸菌中进行了表达，Zhang等将干扰素α2b克隆到pNZ-LEISS， pSP和 pSP-LEISS上，并电转L.lactisNZ9000，并使干扰素α2b产量提高了三倍[9]；陈思维等[29]将人胰岛素基因克隆至乳酸菌表达载体pVE5523，电击转化实现了带信号肽 SPUsp45的人胰岛素基因在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)MG1363和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) ATCC27092中表达，使与免疫耐受相关的细胞因子 IL-4水平显著升高。因此，应用食品级分泌型表达载体表达外源基因，获得重组微生物菌株进行生产纤维素酶前景广阔。

本研究将乳酸菌MG1363中带有的一段编码信号肽的核苷酸序列，设计引物并进行扩增，将其连接质粒pNZ8048，构成分泌型表达载体pNZ-X，通过信号肽基因序列usp45的引导将表达的蛋白分泌到胞外，并在培养基上清中成功检测到了纤维素酶活性，说明本研究构建的pNZ-X可以作为分泌型表达载体，且实现了多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因EG的分泌型表达。本研究成功构建了食品级纤维素酶菌株，为青贮及提高饲料转化率，补充草食动物内源酶，提高畜禽生产性能奠定研究基础。

4 结论

试验分别克隆了多粘类芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切葡聚糖酶基因EG，并分别与连有信号肽序列的分泌型表达载体相连接，成功构建了分泌型表达载体pNZ-X::bglA、pNZ-X::bglB及pNZ-X::EG。

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Secretory expression ofBacilluspolymyxacellulase genebglA、bglBandEGin lactic acid bacteria

LIU Yuan-zi，WANG Yan，WAN Xue-rui，WANG Chuan，WU Run，LIU Gang，WU Zi-xiang

(CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Theusp45 gene ofL.lactisMG1363 was amplified by PCR,cloned into theL.lactisfood grade expression vector pNZ8048 by the score of secretion type expression vector pNZ-X.ThenBacilluspolymyxabeta glucosidase genebglA,bglBand endo beta glucanase geneEGwere cloned into the vector pNZ-X respectively,the recombinant plasmid pNZ-X::bglA,pNZ-X::bglBand pNZ-X::EG,the three plasmids were transfected intoL.lactisNZ9000 to obtain the recombinantL.lactisNZ9000/pNZ-X::bglA,L.lactisNZ9000/pNZ-X::bglBandL.lactisNZ9000/pNZ-X::EG,measured the enzyme activities ofBglA,BglBandEG.The results shown that the size of three enzymes were all in 50Ku.The enzyme activity shown that the enzyme activity ofBacilluspolymyxawas significantly higher than that of the recombinant strain of enzyme by DNS(P<0.05),but has a certain activity.Congo red staining results also shown that the secreted recombinantL.lactiscould produce the enzyme hydrolysis significantly.This study provided a feasible solution for the recombinant expression of cellulase in the food grade strain,and also a foundation for the research of degradation of straw.

lactic acid bacteria;cellulase;Bacilluspolymyxa;secretory expression;enzyme activity assay

2016-09-08；

2016-10-10

甘肃省科技支撑计划项目(1204NKCA103)；国家自然科学基金青年项目(31500067)资助

刘原子(1989-)，男，甘肃省庆阳市人，在读硕士研究生。 E-mail：793168333@qq.com 王川，吴润为通讯作者。

Q 939.99

A

1009-5500(2017)01-0008-06