甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖合成酶基因差异表达分析

王俊刚，赵婷婷，杨本鹏，王文治，蔡文伟，冯翠莲，曾军，熊国如，张树珍（中国热带农业科学院热带生物技术研究所/中国热带农业科学院甘蔗研究中心/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口571101）

甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖合成酶基因差异表达分析

王俊刚，赵婷婷，杨本鹏，王文治，蔡文伟，冯翠莲，曾军，熊国如，张树珍*
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所/中国热带农业科学院甘蔗研究中心/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口571101）

甘蔗种苗经过脱毒处理能够提高甘蔗生物量和糖分，而蔗糖合成酶是甘蔗生长和蔗糖积累的关键性酶。本文分析了2种甘蔗蔗糖合成酶基因SUS4和SUS7在脱毒种苗和常规种苗全生育期的表达量差异。结果表明，SUS4和SUS7在整个生育期叶片和未成熟茎秆中差异表达，苗期是下调表达，其它时期是上调表达，在拔节期成熟茎秆SUS4和SUS7上调表达，而在成熟期成熟茎杆中SUS4和SUS7下调表达，说明蔗糖合成酶基因在脱毒处理过程中，对不同类型蔗糖合成酶基因的时空表达特性的影响不同，而不同的生育期可能不同的蔗糖合成酶基因所起生理功能不同，形成一种相互调控的的基因网络，最终有利于甘蔗产量的形成和蔗糖的累积。

甘蔗；蔗糖合成酶；基因差异表达；Real-Time；脱毒种苗

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是热带、亚热带C4植物，CO2利用率、光合速率、单位面积生物产量和蔗糖含量显著高于其他作物；甘蔗糖占世界蔗糖总量的80%，乙醇生产总量的40%[1]。蔗糖是甘蔗积累的主要物质，而调控蔗糖代谢的关键酶有3种，蔗糖磷酸合成酶（SPS），蔗糖转化酶（INV）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase;SUS，E.C.2,4.1.1 3）。其中，蔗糖磷酸合成酶催化蔗糖合成，蔗糖转化酶催化蔗糖降解，而蔗糖合成酶催化果糖和核苷二磷酸（NDP）（蔗糖+NDP↔NDP-葡萄糖+果糖）之间的葡糖基部分的可逆转移。蔗糖转化的平衡是pH依赖性的，5.5～7.5的pH值促进NDP-葡萄糖形成，7.5～9.0的pH值能够促进蔗糖合成[2－3]。由于蔗糖合成酶具有分解和合成蔗糖的双重属性，所以在调控蔗糖代谢中起更重要的作用，能影响植物整个生物量的形成和糖分积累[4-6]。

蔗糖合成酶被一个小型的基因家族所编码，在拟南芥[7]和水稻[8]有6个SUS基因，毛茛中发现有7个SUS基因[9]。玉米中同源基因Sh1和Sus1编码两种生物活性相似的SUS1和SUS2同工酶[10]。在玉米根尖细胞中，Sh1和Sus1却能被葡萄糖诱导，它们对糖的响应存在显著差异，低浓度葡萄糖促进Sh1基因的表达，抑制Susl基因表达；高浓度葡萄糖则抑制Sh1基因表达，促进Sus1基因表达[11]。此外在大麦和小麦中也对蔗糖合成酶基因表达进行了分析[12-13]。小麦Sus2基因主要在胚乳中表达，而Sus1基因在根和叶中也有表达，低温和厌氧条件能够诱导Sus2基因的表达[14]。进一步研究发现小麦Sus1和Sus2基因位于不同的同源染色体上[15-16]。甘蔗中也分别克隆得到6个SUS基因，并进行单倍型分析，不同品种单倍型和SNP的频率不同[17]；雷美华等[18]分段扩增并克隆了甘蔗SUS基因，该基因属于多基因家族，在分类上属于双子叶SUSA族，所克隆的甘蔗SUS基因全长7545bp，与Lingle等[2]报道的甘蔗SUS序列相似性达到99%。进一步研究分析，SUS基因在不同部位的表达差异明显并且酶活性的变化趋势与蔗糖含量的变化情况相一致，二者呈高度的正相关（相关系数0.995）[19]，说明SUS基因在甘蔗蔗糖积累中可能起非常重要的作用。

甘蔗是多年多季无性繁殖与宿根栽培作物，几乎所有甘蔗品种在大规模应用后均受到多种的危害，导致品种退化，造成甘蔗减产达10%～50%，然而甘蔗是异源多倍体，遗传背景复杂，杂交F1代分离类型繁多，优良基因重组率极低，优良性状的聚合就更难。致使传统的‘五圃制’育种程序长达10～15年，育种效率很低。于是采用热处理结合腋芽分生组织培养技术培育的脱毒健康种苗能够有效延长优良品种使用年限，恢复母本优良性状，提高甘蔗产量和蔗糖含量[20-21]，但从分子水平解释增产和增糖机理还未见报道。本文利用已报道的两个蔗糖合成酶基因SUS4和SUS7为研究对象，分别从甘蔗生长的苗期、分蘖期、拔节期和成熟期对其表达量进行比较分析，探讨脱毒处理对蔗糖合成酶表达量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为新台糖22号品种和其经过腋芽脱毒健康种苗二代种茎苗，材料来源于中国热带农业科学院甘蔗研究中心。种植于海南省临高县皇桐镇国家甘蔗产业技术体系试验站。田间试验设计和管理办法见参照文献[21]的有关方法进行。

1.2 总RNA提取与cDNA的合成

每个样品从10个生长一致植株进行混合取样，甘蔗成熟叶片为+3叶、未成熟叶片为0叶，茎杆由生长点向下计算甘蔗茎节数，每个样品取3个生物学重复。取得的样品在液氮中进行研磨，按照Trizol法提取总RNA，并参照TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒的方法进行反转录。

1.3 引物设计

根据公布的甘蔗蔗糖合成酶基因SUS4(GenBank登录号：KM598653.1)、SUS7(GenBank登录号：BU925832.1)序列利用primer3设计引物，内参GADPH基因引物参考[22]设计。

表1 引物序列、PCR扩增基因片段和扩增效率Table 1 Primer sequences, the am p lified fragments and am p lification efficiency

1.4 RealTime-PCR扩增及数据分析

建立20μL荧光定量PCR反应体系，选用SYBR®Premix Ex TaqTM（TaKaRa）试剂盒，按照说明书操作要求配制，反应在Mx3005P上完成，每个处理设置3次试验重复，扩增效率见表1。以甘蔗GADPH基因为内参基因，所有结果以2-ΔΔCT法计算相对定量值[23]。

2 结果与分析

2.1 苗期蔗糖合成酶基因表达分析

Q-PCR结果显示：SUS4和SUS7基因在苗期甘蔗叶片中均有表达；在未成熟叶片中SUS4比对照低2倍多，SUS7比对照低40%左右；而在成熟叶片中，SUS4和SUS7比对照低2倍左右（结果见图1）。

图1 甘蔗苗期不同组织蔗糖合成酶基因相对表达量Fig.1 Relative gene expression level of sucrose synthetase genes in different sugarcane tissues at seedling stage

2.2 分蘖期蔗糖合成酶基因表达分析

选择甘蔗分蘖中期蔗糖合成酶基因表达特征进行分析。在甘蔗第一棵分蘖苗长出7d后，对主茎甘蔗叶片进行采样。结果表明：SUS4在分蘖期脱毒健康种苗未成熟和成熟叶片中表达量分别比对照高3倍左右；SUS7在分蘖期脱毒健康种苗未成熟和成熟叶片中表达量分别比对照高4倍和5倍（结果见图2）。

2.3 拔节期蔗糖合成酶基因表达分析

SUS4表达量在拔节期脱毒健康种苗叶片中比对照无明显差异，而在茎秆中伴随成熟度的增加表达量逐渐降低，在1～5茎节中表达量比对照高3倍左右，7～23节其表达量与对照无明显差异；SUS7表达量在拔节期脱毒健康种苗叶片中比对照高3倍，而在茎秆伴随成熟度的增加表达量逐渐降低，在1～5茎节中表达量最高，比对照高2倍左右，在10～23节中表达量趋向一致，与对照无明显差异（见图3）。

图2 分蘖期甘蔗不同组织蔗糖合成酶基因相对表达量Fig.2 Relative gene expression level of sucrose synthetase gene in different sugarcane tissues at tiller grow th stage

图3 拔节期甘蔗不同组织蔗糖合成酶基因相对表达量Fig.3 Relative gene expression levels of sucrose synthetase genes in different sugarcane tissues at elongation grow th stage YL：未成熟叶片；ML：成熟叶片；1：1～3节；2：4～5节；3：7～8节；4：10～11节；5：13～14节；6：16～17节；7：19～20节；8：22～23节YL:young leaf;ML:mature leaf;1:1-3 internodes;2:4-5 internodes;3:7-8 internodes;4:10-11 internodes;5:13-14 internodes;6:16-17 internodes;7:19-20 internodes;8:22-23 internodes

2.4 成熟期蔗糖合成酶基因表达分析

SUS4在成熟期脱毒种苗未成熟叶片中表达量比对照高出2倍左右，成熟叶片中高出接近3倍；在1～3节中比对照高3倍左右，伴随节间成熟度增加，表达差异逐渐降低，到7～8节时差异不明显，13～14节后比对照低2倍左右；SUS7在成熟期脱毒种苗叶片中表达量比对照高5倍左右，在1～3节中比对照高7倍左右，伴随节间成熟度增加，表达差异逐渐降低，到10～11节时仍比CK高；13～14后比对照低2倍左右（见图4）。

图4 成熟期甘蔗不同组织蔗糖合成酶基因相对表达量Fig.4 Relative gene expression level of sucrose synthetase gene in different sugarcane tissues atmature grow th stage YL：未成熟叶；ML：成熟叶；1：1～3节；2：4～5节；3：7～8节；4：10～11节；5：13～14节；6：16～17节；7：19～20节；8：22～23节；9：29～30节；10：36～37节YL:young leaf;ML:mature leaf;1:1-3 internodes;2:4-5 internodes;3:7-8 internodes;4:10-11 internodes;5:13-14 internodes;6:16-17 internodes; 7:19-20 internodes;8:22-23 internodes；9:29-30 internodes;10:36-37 internodes

3 讨论

甘蔗脱毒健康种苗能够有效提纯复壮优良的品种，保证其生产潜力，延长品种使用年限。关于脱毒健康种苗在基因水平与未脱毒的比较还很少报道[24]。蔗糖合成酶是蔗糖代谢调节中的关键酶，在调节植物细胞碳水化合物的分配和库器官中蔗糖强度发挥重要作用[25-26]。对柑橘6种蔗糖合成酶基因的组织表达特性分析表明，蔗糖合成酶基因在柑橘新老叶片、花和果实中表达存在差异，其中Sus1、Sus2、Sus5、Sus6在柑橘果肉中高表达，Sus3和Sus4在幼叶中表达量高，但在成熟的叶片中表达量很低，在果实形成过程中，果肉中Sus5表达快速积累，而Sus6含量却逐渐下降[27]。对桃树Sus基因家族的研究表明，果实中PpSus表达量与桃果的发育阶段存在联系[28]。杨树中过表达棉花Sus可显著加快木质部纤维素积累和次生壁加厚，改变糖的分配途径[29]。各种SUS基因表达量和表达部位的不同，也决定了其在糖分和碳分配不同阶段的作用不同。

甘蔗脱毒健康种苗叶片中SUS4和SUS7在不同生长阶段比对照差异表达明显，苗期蔗糖合成酶基因表达明显低于对照，可能此阶段蔗糖合成酶表达量的降低有利于单糖的积累，促进叶片的快速生长；而经过苗期后，叶片的生理功能发生变化，蔗糖合成酶表达的升高，有利于蔗糖输出，为其它生长部位提供更多的碳源。SUS4和SUS7在脱毒健康种苗快速生长的1～8茎节中的表达明显高于对照，可能是脱毒茎节相对生长旺盛，需要更多的碳源进行蔗糖的累积，因此进一步需要更多的蔗糖合成酶的表达，合成更多的蔗糖；在拔节期7～8节之后的茎节，SUS4和SUS7表达没有变化，可能此两种基因的表达对蔗糖合成酶活性的影响不明显。另外在成熟茎节中表达量降低，能够有效抑制分解方向的活性，促进甘蔗糖分积累，提升甘蔗品质。通过对整个生长期脱毒健康种苗和非脱毒苗中的蔗糖合成酶差异表达研究表明：蔗糖合成酶基因与甘蔗蔗糖积累有一定的相关性，而不同的生长期可能不同的蔗糖合成酶基因所起功能不同，形成一种相互调节的网络，有利于最终甘蔗产量的形成和蔗糖的累积。

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Differential Expression Analysis of Sucrose Synthase Genes in Disease-free Sugarcane Seed lings

WANG Jun-gang,ZHAO Ting-ting,YANG Ben-peng,WANGWen-zhi,CAIWen-wei,et al
(Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture,Haikou 571101,Hainan)

The biomass and sugar content can be improved in disease-free sugarcane seedling.Sucrose synthase is the key enzyme for sugarcane growth and sucrose accumulation.The expression differences of sucrose synthase genes,SUS4 and SUS7,were analyzed in disease-free sugarcane seedlings at different growth stages.The results showed that the expression levels of SUS4 and SUS7 were down-regulated in sugarcane leaves and immature internodes at seedling stage but up-regulated in sugarcane leaves and immature internodes at tillering,elongation and mature stages.Moreover,the expression levels of SUS4 and SUS7 were up-regulated in sugarcane mature internodes at elongation stage but down-regulated in sugarcane mature internodes at mature stage.It demonstrated that the expression patterns of SUS4 and SUS7 were differently regulated in different sugarcane tissues at different growth stages through disease-free treatment.The expression differences of SUS4 and SUS7 showed that different types of sucrose synthase together functioned to regulate sucrosemetabolism,and further to facilitate sucrose accumulation and biomass formation.

sugarcane;sucrose synthase;gene difference expression;Real-Time;disease-free seedlings

S566.103；Q 78

A

1007－2624（2017）04－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.04.001

2017-03-30

“863”计划（2013AA102604-1）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（ITBB2015RC04，ITBB2015ZY12）；海南省自然科学基金（20163124）。

王俊刚（1982-），博士研究生，助理研究员，研究方向：甘蔗生物技术，E-mail：wangjungang@itbb.org.cn

张树珍（1965-），博士，研究员，博士生导师，主要从事甘蔗生物学的研究，E-mail：zhangsz2007@163.com