高糖下视网膜Müller 细胞生长活性的变化

胡淑鸾 过贵元

（福建漳州卫生职业学院，福建 漳州 353600）

糖尿病性视网膜病变（DR）是成人视力丧失和视力障碍的主要原因[1]。Müller 细胞是视网膜主要神经胶质细胞，起着保护、支持神经细胞作用，其在高糖环境下可以促进VEGF 和纤维化因子的表达从而加重DR 的病变等[2-4]。本研究通过测量Müller细胞不同程度的高糖培养条件下生长活性的变化，推测Müller 细胞在糖尿病性视网膜病变进展中的活性变化，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 Müller 细胞的培养：取约14周龄成年雄性大耳白兔，处死后无菌剪取周边视网膜神经上皮层，将视网膜剪成1mm×1mm 小块后置于培养瓶中，间隔约5mm，于5% CO2、37℃培养箱中培养约1h 后，加入少许20%胎牛血清的DMEM/F12 培养液进行培养，置于5% CO2，37℃培养箱中静置培养，第2天加入足量同样培养液，培养7d 后通过弯头吸管反复轻轻吹打培养的组织块使其解体后，置换上新鲜培养液，每4d 换一次液直至细胞达80%以上融合后，0.25%Trypsin-EDTA 消化 10min 后加入含胎牛血清的DMEM/F12 培养液，吹打成细胞密度约104/mL 悬浮液，取等量的细胞悬浮液置入含有玻片的12 孔培养板或96 孔培养板进行培养（不同浓度、不同培养时间均设有 4 孔）；在 2d、4d、6d 置换上等量含有不同条件（A：正常组、B：10mmol/L、C：25mmol/L、D：50mmol/L 的 4个组） 的无血清培养液，第7 天取出培养板进行进一步实验研究。

1.2 兔视网膜Müller 细胞鉴定：①显微镜下观察不同培养条件下的细胞生长形态；②荧光免疫组化染色标记：取培养于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液的细胞玻片，PBS 清洗，4% Polysorbate 固定液 30 min，0.1% TritonX-100 10 min，0.3% H2O2甲醇溶液30 min，10% 正常山羊血清 20 min；加入兔抗GFAP 和抗CRALBP 抗体，对照组加PBS，37℃孵育1h 后清洗；加入相应的荧光二抗，室温避光1h，PBS 清洗后DAPI 染色 15 min。抗荧光催灭封片剂进行封片处理。荧光显微镜下观察及拍照；③透射电镜：原代细胞经0.25%Trypsin-EDTA 消化、离心成细胞团，3%Glutaraldehyde～1.5%Polysorbate-0.1MPBS 固定 4h，1%Osmium tetroxide ～1.5%Potassium ferrocyanide 后固定 2h，618 包埋剂包埋，薄切片机切 70～80 nm 的薄片；Uranyl acetate 染色、Lead citrate 染色，清洗；通过透射电镜进行观察及摄片。

1.3 细胞活性测定（MTT 法）：第7 天取出不同培养条件的 96 孔培养板，A：正常组、B：10mmol/L、C：25mmol/L、D：50mmol/L 的 4个组，培养天数分别为1d、3d、5d，每组内不同培养时间设置4个平行孔；加入20μL MTT 溶液继续培养4h，取出，弃上清液后加入100μL DMSO，振荡，待沉淀物溶解充分后，置于波长设定为490nm 的酶联免疫检测仪，检测培养板各孔的光吸收OD 值。

1.4 统计学处理：运用SPSS 11.0 软件分析数据，计量资料采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Müller 细胞的鉴别：兔周边视网膜组织块培养约3d，培养块周边可见有细胞突起伸出，培养7d见组织块周围长满细胞，呈放射状，细胞在培养3周后见细胞生长形态稳定并粘附与整个培养瓶瓶底。培养的细胞在荧光免疫组化标记处理后RALBP、GFAP、细胞核分别呈绿色、红色、蓝色，RALBP、GFAP 阳性率均95% 以上。通过电镜观察，Müller 细胞膜上有丰富微绒毛，胞浆内含有丰富线粒体、微丝、核糖体、糖原颗粒、粗面内质网等细胞器，细胞核较大，常有多核仁。

2.2 兔视网膜Müller 细胞活性：①培养1d，浓度为25mmol/L、50mmol/L 葡萄糖组较对照组平均光吸收OD 值高，差异有统计学意义（P<0.05），并随浓度的增加，其OD 值增加；②培养天数3d、浓度10mmol/L 葡萄糖组所测得的OD 值较对照高（P<0.05），而浓度为25mmol/L、50mmol/L 葡萄糖组较对照组无显著变化，其随着浓度增加呈下降趋势；③第5 天时高浓度组的OD 值与对照组对比差异有统计学意义（P<0.05），均随着浓度增加呈下降趋势；④培养天数3d、5d 组，高糖各组测得的OD 值明显低于培养1d（P<0.05），并呈现出递减性下降，详见表1。

表1 不同浓度葡萄糖各组Müller 细胞的OD 值 （）

表1 不同浓度葡萄糖各组Müller 细胞的OD 值 （）

注：与正常组比较*为P<0.05，**为P<0.001；葡萄糖组内与培养 1 天组比较 △为 P<0.05，△△为 P<0.001

葡萄糖浓度（mmol/L） 样本数 时间（d）1 3 5 F 值 P 值对照组 4 0.83±0.03 0.82±0.05 0.83±0.070.057 0.945 10 4 0.96±0.07 0.93±0.05* 0.87±0.02△ 3.552 0.073 25 4 0.99±0.06* 0.83±0.06△ 0.74±0.04*△△ 22.797 0.000 50 4 1.05±0.08* 0.79±0.05 0.74±0.05**△△ 28.645 0.000 F 值 6.732 5.859 9.429 P 值 0.006 0.011 0.002

3 讨论

DR 为致盲率较高的糖尿病并发症，其主要是高血糖引起视网膜血循环障碍：微血管自我调节功能紊乱、异常的血流变，视网膜各层细胞组织变性从而造成视功能障碍等[5-6]。本研究通过模拟糖尿病时体内微环境，设置浓度为10mmol/L、25mmol/L、50mmol/L 体外高糖状态培养条件，通过测定各不同程度的高糖环境、培养天数组的平均光吸收OD值，其高糖组的Müller 细胞的活性早期呈现增强状态，而当高浓度葡萄糖作用时间延长后，显微镜下见Müller 细胞形态逐渐出现改变，其所测得OD 值提示生长出现减弱，并与浓度高低相关：浓度增加，抑制作用更为明显。我们推测高血糖可刺激Müller细胞增殖而加速糖尿病性视网膜病变的增殖病理进程，如果血糖长时间存在较高或病情延长，此时Müller 细胞的活性受到影响，再生增殖能力减弱以至于数量减少到不能维持正常生理功能，亦能加重糖尿病性视网膜病变各种病理变化。