非小细胞肺癌中CDKN2A 蛋白表达及其与临床分期及预后的关系

李俊彦 招轩娜

（广东医科大学附属医院，广东 湛江 524001）

非小细胞肺癌是一种恶性肿瘤，发病率约占肺癌的80%。肺癌患者通常预后不良，在早期时易出现远处转移，但目前关于肺癌的发病机制尚不十分明确。本研究旨在探讨非小细胞肺癌中CDKN2A蛋白表达及其与临床分期及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2019年10 月至2020年10月我院收治并手术治疗的非小细胞肺癌患者80例作为研究对象，其中男性48例，女性32例；年龄33～75（60.82±11.23）岁；腺癌 45例，鳞癌 35例。

1.2 方法：采用Western-blot 法测定非小细胞肺癌组织及非肿瘤组织中CDKN2A 的表达，提取标本中的总RNA，采用RT-PCR 试剂盒扩增，总反应体系为 25μL，包括 4μL RNA 模板，上游引物 2μL，下游引物 2μL，2×Tap PCR Master Mix12μL，剩余为双蒸水。95 ℃预处理5 min 后进入循环反应，热变性温度为95℃，时间为30s；延伸温度为72℃，时间为30s；退火时间为 30s；退火温度为 60℃、61℃、59℃，均为30个循环；最后进行延伸，时间为10 min。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行检测。采用常规蛋白提取法提取肿瘤组织和非肿瘤喉组织中的总蛋白，行电泳分离，利用硝酸纤维素膜进行转膜，采用浓度为5%的脱脂奶粉并加1 倍磷酸盐缓冲液进行封闭，置于4℃下保存。取出后与CDKN2A 进行反应，以 1∶1000 的比例进行稀释，室温下放置1 h，第二抗体用辣根过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，以1∶1000 的比例进行稀释，温下放置1h，采用 DAB 显色试剂 1∶100 比例稀释后显色，使用凝胶图像处理系统分析目标带密度值。评分标准：0 分：阳性细胞比例低于5%；1 分：阳性细胞比例为5%～25%；2 分：阳性细胞比例为26%～50%；3分：阳性细胞比例为51%～75%；4 分：阳性细胞比例超过75%。染色强度：0 分：无着色，1 分：黄色，2分：棕黄色，3 分：棕褐色；最终评分为两项得分的乘积：阴性组：得分低于3 分，阳性组：得分≥3 分，其中低表达：得分低于5 分，高表达：得分≥5 分。

1.3 统计学分析：运用SPSS20.0 软件行数据分析，计量资料以[n（%）]形式显示，采用 χ2检验；计数以（）形式显示，采用 t 检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDKN2A 蛋白水平的表达与临床分期的关系：CDKN2A 表达产物位于细胞胞浆中，呈为棕黄色染色颗粒。CDKN2A 蛋白在非小细胞肺癌肿瘤组织中的高表达率为58.75%，在癌旁组织中的高表达率为23.75%，非小细胞肺癌肿瘤组织中的CDKN2A 蛋白表达高于癌旁组织（χ2=20.220，P=0.000）。非小细胞肺癌肿瘤组织中的CDKN2A 蛋白水平的表达与临床分期的有关（P<0.05），详见表1。

表1 CDKN2A 蛋白与临床分期的关系

2.2 CDKN2A 蛋白与预后的关系：CDKN2A 蛋白高表达非小细胞肺癌患者总生存期低于低表达组，差异有统计学意义（HR=1.31，P=0.01）；CDKN2A 高低表达组间非小细胞肺癌患者无疾病进展生存差异无统计学意义（HR=0.93，P=0.58）。

3 讨论

肺癌是一种高发的呼吸系统恶性肿瘤。非小细胞肺癌的恶性程度较高，切治疗难度较大，故及早发现对预防非小细胞肺癌转移具有十分重要的意义。因此，参与细胞周期调控、基因改变等成为临床研究热点。CDKN2A 直接参与了细胞周期调控，是一种新型的抗癌基因，被称为细胞周期中的刹车装置，若发现其失灵后则会使细胞发生恶性增殖，进而形成恶性肿瘤[3]。研究发现，CNKN2A 在多种肿瘤组织中均呈现出差异表达，且呈现表达上调，与患者的病理特征与预后具有相关性[4]。然而，CDKN2A在非小细胞肺癌中表达的研究报道较少，CD KN2A高低表达与非小细胞肺癌患者的预后情况也尚不明确[5]。CDKN2A 基因在细胞周期调控中具有较明显的肿瘤抑制作用，CDKN2A 在许多肿瘤中均出现丢失和突变。探讨CDKN2A 在非小细胞肺癌组织中的差异表达，可能发现其与细胞生物学功能及患者预后的关系。

贺小威等的研究结果曾报道[6]，非小细胞肺癌组织中CDKN2A 蛋白的表达显著高于癌旁组织，CDKN2A 蛋白表达水平与患者的OS 有关。本研究结果显示，本研究结果与贺小威等[6]的数据基本一致。结果说明CDKN2A 蛋白在非小细胞肺癌组织中表达上调，CDKN2A 蛋白的高表达与患者的临床分期和预后较差有关。

综上所述，CDKN2A 蛋白在非小细胞肺癌肿瘤组织中表达上调，其表达水平与患者的临床分期和生存期有关，CDKN2A 可作为非小细胞肺癌患者临床分期及预后预测的标志物。但本研究仅从生物信息的层面进行了证实，后期仍需进行相关分子生物学实验验证。