结核感染药物治疗中耐药突变基因检测结果分析

范常龙，孔繁慧，辛瑞敏，纪滨英

(哈尔滨市胸科医院，黑龙江哈尔滨150056)

我国目前耐多药结核的发病率为8.32%。结核病疫情回升主要原因有流动人口的增加、诊断治疗的延误、抗结核药物的不规范治疗，病人体内的结核菌发生基因突变对多种抗结核药物发生耐受性。耐多药结核病(MDR－TB)病例增加，治疗越来越困难。患者必须使用二线甚至三线药物治疗，这些药物的毒副作用大、价格昂贵、疗程长而疗效低。病人长期痰菌阳性必将增大传染概率，形成恶性循环，导致原发耐药结核病大量增加，治疗更困难。

1 材料和方法

1.1 研究对象:入选患者是2012年2月至2013年3月在我院住院的结核患者两组各60例，统计耐药肺结核疾病患者应用耐药突变基因检测药敏结果。肺结核诊断主要是根据临床症状、痰检及影像检查并参照肺结核的诊断标准排除其他疾病后确诊［1］。

1.2 主要试剂和仪器:结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒是亚能生物技术(深圳)有限公司生产提供;痰快速培养(BACTEC MGIT 960培养系统)美国Becton Dickinson Microbiology Systems生产;细胞培养箱;HR40－ⅡA2型生物安全柜。

1.3 方法

1.3.1 结核分枝杆菌耐药突变基因检测:收集临床痰样，加入等量的化痰试剂(4%的NaOH)，充分振荡化痰处理15～30 min，直至痰液完全液化。转移1.2 mL痰样消化液到1.5 mL离心管中，12000转/min，离心5 min，弃上清。临床分离培养的菌株:转移1.2 mL样本到1.5 mL离心管中，12000转/min，离心5 min，弃上清，收集沉淀。按照上述方法继续收集沉淀，直到满足所需的量。

加入1 mL MTB洗液，充分混匀，12000转/min，离心2 min，弃上清;加入50 μL MTB裂解液，充分混匀，于沸水中煮10 min。12000转/min，离心2 min，上清液即可作为PCR模板，进行PCR扩增。

杂交、洗膜和显色:PCR产物在沸水中加热变性10 min;59℃杂交1.5 h。取出膜条，移至装有预热B液的50 mL管中，于59℃轻摇洗涤15 min。POD溶液孵育30 min;用A1室温洗两次，5 min/次;显色液中避光显色5～10 min。

1.3.2 其他检测方法:痰改良罗氏比例法培养和药敏;痰快速培养和药敏用的是BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪。1.4 统计学方法:结果用SPSS 17.0分析软件作卡方检验统计学分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随机选取两组肺结核感染患者各60例，分别用耐药突变基因实验和痰快速培养药敏对比检测:利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的药敏耐药结果的百分率分别为35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分别为 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均＞0.05，说明两种方法的差异没有统计学意义，见表1。

表1 耐药突变基因和痰快速培养药敏四种药物耐药结果百分率情况 例(%)

2.2 若不考虑耐多药情况，只计算每种药物的耐药和耐药突变位点，对91例耐药肺结核疾病患者应用耐药突变基因检测药敏结果，利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的耐药率分别是48.35%(44/91)，94.51%(86/91)，49.45%(45/91)，25.27%(23/91)。四种药物相应最常见突变位点分别为S531L、－15M、43M、306M2，分别占该药突变位点检出总数的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%，见表 2。

表2 结核病患者耐药基因突变位点情况

3 讨论

本试验应用结核分枝杆菌耐药突变基因检测试剂盒和痰快速培养药敏方法对两组肺结核感染患者各60例药敏耐药结果进行对比，得出的利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的耐药百分率分别为 35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分别为 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均 ＞0.05，说明两种方法的差异无统计学意义。结果显示，耐药突变基因检测方法与传统方法相比较没有差异，具有较高敏感性，接近国外报道［2－3］。说明耐药突变基因检测法具有灵敏度好、特异性高、假阳性率低的特点，为临床制定合理的治疗方案提供可靠的客观依据。

本研究结果表明耐药突变基因检测方法在检测结核感染患者方面比其他方法更加快速、准确性没有差异，其鉴别诊断价值也得到了广泛的认可，对临床诊断治疗十分重要。主要原因由于痰液细菌学检查的局限性，结核分枝杆菌培养药敏需时过长，平均16.2 d。耐药突变基因检测可直接运用痰样进行检测，无须培养，仅需要不到2 d时间，缩短了耐药检测的时间。对MTB的临床样本最低检测限为1.0 ×104copies/mL［4］。耐药突变基因检测在结核感染耐药药物治疗方面优于其他方法，初治结核病人进行耐药检测，在治疗前就了解病人的耐药情况，可以减轻初治耐药病人的负担。

本实验研究显示最常见突变位点为－15M，其余依次为43M，S531L，315M，88M，306M2。四种药物相应最常见突变位点分别为S531L、－15M、43M、306M2，分别占该药突变位点检出总数的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%。肺结核疾病患者利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的耐药率分别是48.35%，94.51%，49.45%，25.27%。这一结果与沈阳［5］，南宁［6］等地区结核病患者耐药结果不同，提示不同地区结核杆菌流行菌株可能不同。为治疗中和治疗后结核病人提供重要的耐药信息，指导临床合理用药，有利于结核病的个体化治疗。保证治疗效果及减少耐药菌株的扩散。

［1］ 中华医学会.临床诊疗指南(结核病分册).北京:人民卫生出版社，2005:64 －86.

［2］ 单万水，吴驰，陈心春等.基因芯片技术在结核分枝杆菌耐药突变基因检测中的应用［J］.国际检验医学杂志，2008，11:112－114.

［3］ Wade MM，Volokhov D，Peredelchuk M，et al.Accurate mapping of mutations of pyrazinamide－resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning － frame oligonucleotide microarray［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2004，49(2):89 －97.

［4］ Maureen Morgan，Shriprakash Kalantri，Laura Flores，et al.A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta－ analysis［J］.BMC Infect Dis，2005，5:62.

［5］ 奚莹，王莉.301例肺结核患者痰培养阳性菌株耐药情况分析［J］.中国医师杂志，2010，12(11):1561 －1563.

［6］ 孙亚红.1207例结核杆菌耐药分析［J］.广西医学，2011，33(11):1492－1493.