带状疱疹皮损组织中CD8，FoxP3和OX40的表达研究

杨 励 尚亚洲 王一理 张美芳（通讯作者）

（1.陕西省人民医院皮肤科，陕西西安710068；2.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西西安710061）

带状疱疹皮损组织中CD8，FoxP3和OX40的表达研究

杨 励1尚亚洲1王一理2张美芳1（通讯作者）

（1.陕西省人民医院皮肤科，陕西西安710068；2.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西西安710061）

目的探讨带状疱疹（HZ）皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的表达情况和意义，初步探讨OX40和CD8+Tregs细胞在HZ疾病过程中的作用机制。方法应用免疫组化法检测9例HZ患者皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的表达情况，并分析其在不同临床病情HZ患者皮损组织中的表达差异。结果带状疱疹皮损组织中CD8、FoxP3和OX40的阳性表达率与病情有统计学意义（P<0.05），但与年龄无关（P>0.05）。HZ皮损组织中CD8、FoxP3和OX40间呈正相关（P<0.05）。结论CD8、FoxP3和OX40可能在HZ的发生发展中起重要作用，共刺激分子OX40可能促进了CD8+Tregs细胞生成发挥作用。

带状疱疹：协同刺激分子OX40；CD8+调节性T细胞

带状疱疹（Herpes zoster，HZ）是水痘带状疱疹病毒（Varicella-zostervirus，VZV）潜伏在感觉神经节的一次复发，本病发生被认为是免疫抑制的后果[1]，特别是在免疫低下的宿主高发病率和高死亡率。HZ的皮损中不但有坏死的角质形成细胞，还存在大量的免疫细胞，包括淋巴细胞、中性粒细胞等，这些细胞具有抗病毒活性，因此说HZ局部皮肤受损不单是VZV在细胞内繁殖的直接结果，还需通过一系列细胞免疫应答造成组织损伤[2]。研究HZ局部皮损，将有可能阐明病毒和免疫细胞间相互作用的免疫学机制，HZ患者皮损局部的免疫细胞及相关分子的变化可能直接反映机体抗病毒免疫的本质。

调节性T细胞（Regulatory cells，Tregs）是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能够抑制自身反应性T细胞的活化和增殖，在病毒感染等状态下起重要作用。继CD4+Tregs后，有学者又发现一高表达Foxp3的CD8+的Tregs细胞，对自身反应性T细胞也有免疫抑制作用[3]。研究表明在病毒感染中CD8+ Tregs细胞增加，影响机体的抗病毒免疫反应。但迄今为止，未见CD8+Tregs细胞在带状疱疹皮损局部的研究报告。FoxP3是决定CD8+Tregs细胞功能的关键基因[4]，CD8+Tregs细胞的免疫抑制作用也受各种因子和受体的多种机制的调节，其中近年来研究发现的共刺激分子OX40/OX40L，是启动特异性T细胞免疫应答所必需的信号[5]。本研究探讨CD8、FoxP3和OX40在HZ局部皮损中的表达及相互关系，探讨其在HZ发病机制中的作用和临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象：选取2012年至2013年在陕西省人民医院皮肤科就诊的9例带状疱疹患者，所有患者均为首次发病，患者最小年龄21岁，最大年龄76岁，中位年龄62岁。收集局部皮损9例。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情同意。组织标本经10%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋备用。

1.2 试剂：鼠抗人CD8（IgG1）单克隆抗体（福州迈新生物技术开发公司）；鼠抗人FoxP3（IgG1）单克隆抗体（英国Abcam Laboratories Ltd）；鼠抗人OX40（IgG2a）单克隆抗体（英国Novocastra Laboratories Ltd）；EnVision试剂盒（丹麦Dako公司）。

1.3 实验方法：采用免疫组织化学EnVision二步法单染色法，5 μm连续切片，常规脱蜡，0.01 mol/L柠檬酸或0.001 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）缓冲液高温高压进行抗原修复，一抗浓度分别为OX40（1：20）、FoxP3（1：30）、CD8（1：80），单染法采用辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合，DAB显色液显色，苏木素复染，梯度酒精脱水至二甲苯，中性树胶封片。免疫组化检测结果判定：OX40阳性标记产物呈棕黄色颗粒定位于细胞膜，FoxP3标记阳性产物呈蓝黑色颗粒定位于细胞核，CD8标记阳性产物呈棕黄色颗粒定位于细胞膜。每张切片计数以400×高倍镜下随机选择5个不重复视野，计数阳性细胞数，并求得平均值进行统计分析。

1.4 统计学处理：应用SPSS18.0对数据进行统计分析。不同年龄、不同病情的带状疱疹患者皮肤组织中3种分子阳性表达率的比较采用χ2检验，皮损组织中各分子间相关分析用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 带状疱疹患者病情评分标准：根据文献[6]对带状疱疹患者的病情进行评分，总分<6分为轻度，6～12分为中度，>12分为重度。

2.2 不同临床病情HZ患者皮损组织中3种分子的表达：在不同病情的HZ患者组织中均可见CD8、FoxP3和OX40的表达，它们在组织中数量与病情轻重有相关性（χ2=7.059，6.468，6.664，P值分别为0.029、0.039和0.036），详见图1，而它们在组织中的表达与年龄（<60岁和>60岁）无相关性（χ2= 0.824，0.281，0.610，P值分别为0.364，0.596，0.435）。

图1 不同临床分型的HZ患者皮损组织中CD8、FoxP3、OX40的表达

2.3 带状疱疹皮损组织中CD8、FoxP3、OX40表达的关联性分析：皮损组织中3个分子间均呈正相关（r=0.002，0.926，0.735，P值分别为0.002，<0.001和0.024）。

3 讨论

目前，多数学者倾向认为HZ的发生与机体对VZV的特异免疫功能调节紊乱有关，而前期研究发现，HZ患者外周血T细胞亚群失衡，CD4+T/CD8+T细胞比值下降，导致细胞免疫功能抑制[7]。CD8+Tregs细胞是已确定存在的具有免疫调节功能的细胞，FoxP3是其在发育和功能上必需的分子，在细胞介导的免疫抑制效应中起关键作用。在疱疹病毒感染研究中发现，CD8+Tregs细胞数增加，本研究也证实在VZV感染的带状疱疹局部皮损中CD8+Tregs细胞数也增加，特别是随着皮损程度的加重，增加的更为明显，提示CD8+Tregs细胞的改变是因需在局部发挥抗病毒免疫抑制作用所致。同时研究也发现，随着年龄增加，CD8+Tregs细胞也逐渐增高[8]，HZ局部CD8+Tregs细胞增加，促进局部免疫抑制的作用，有利于病毒逃脱机体的抗病毒免疫反应，这表明CD8+Tregs细胞在HZ发生、发展的免疫过程中有重要的意义。

本研究也对9例带状疱疹患者局部皮损进行了检测，结果显示，HZ患者皮损中存在OX40的改变，随着皮损严重性增加，OX40的表达也增加，提示皮损中OX40细胞在疾病的发生发展和病情的持续中均发挥作用，也提示OX40表达可能与HZ严重程度有一定关系，说明OX40表达与临床绝对评分之间存在一定对应关系。

皮肤作为抵御感染的主要屏障，皮肤的免疫作用也逐渐引起研究者的重视，在HZ发生发展的过程中，VZV损伤皮肤局部，这与皮肤局部免疫应答低下等多种因素有关，研究皮损局部比外周血免疫状态可能更准确地反映皮肤的免疫应答能力。但在诊疗过程中取材受限制，本研究收集的样本数少。然而，轻中重不同病情的患者皮损局部的免疫分子变化具有临床意义，因此，今后需要加大样本量，进行更深一步的研究，同时还需考虑病情发展过程中各免疫分子的变化，以及和全身抗病毒免疫反应状况的对比。

［1］Kim JW，Min CK，Mun YC，et al.Varicella-zoster virusspecific cell-mediated immunity and herpes zoster development in multiple myeloma patients receiving bortezomib-or thalidomide-based chemotherapy［J］.J Clin Virol，2015，73（2）：64-69.

［2］Imoto K，Okazaki A，Onishi F，et al.VZV skin-test reaction，but not antibody，is an important predictive factor for postherpetic neuralgia［J］.J Dermatol Sci，2015，79（3）：235-240.

［3］李雅舒，王莉，陈晓玲.CD8+CD28-调节性T细胞的生物学特性及其与疾病的相关性研究进展［J］.免疫学杂志，2012，8（28）：722-725

［4］Singh RP，La Cava A，Wong M，et al.CD8+T cell-mediated suppression of autoimmunity in a murine lupus model of peptide-induced immune tolerance depends on Foxp3 expression［J］.J Immunol，2007，178（12）：7649-7657.

［5］卢凯，陈明.OX40/OX40L与T细胞［J］.东南大学学报（医学版），2012，31（3）：355-358.

［6］泛昔洛韦治疗带状疱疹临床观察组.泛昔洛韦与阿昔洛韦治疗带状疱疹的多中心随机双盲对照研究［J］.中华皮肤科杂志，2000，33（5）：370-371.

［7］张美芳，杨励，马学良，等.带状疱疹患者T细胞亚群及相关细胞因子的检测［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2009，8（3）：133-135.

［8］Weng NP，Akbar AN，Goronzy J.CD28（-）T cells：their role in the age-associated decline of immune function［J］.Trends Immunol，2009，30（7）：306-312.

Expressions of CD8，FoxP3 and OX40 in Herpes Zoster Skin Lesion

Yang Li1Shang Yazhou1Wang Yili2Zhang Meifang1
（1.Department of Dermatology，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi’an 710068，China；2.The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，Institute for Cancer Research，School of Life Sciences&Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

ObjectiveTo study the expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in in herpes zoster（HZ）skin tissue，and then to explore the pathogenesis of OX40 and CD8+Tregs in H．MethodsThe expressions of CD8、FoxP3 and OX40 were detected by immunohistochemistry in 9 cases HZ.ResultsThe expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in HZ tissue were significantly associated with state of disease.No correlation were found among the expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in different age groups.OX40 expression was positively associated with CD8 and FoxP3 expression in HZ.ConclusionCD8，FoxP3 and OX40 molecule may play a role in the HZ.Further more，OX40 might stimulate the expression of CD8+Tregs and contribute to the development of HZ.

Erpes zoster；Co-stimulatory molecule OX40；CD8+regulatory T cells

R752

A学科分类代码：32047

1001-8131（2017）01-0019-02

2016-09-05