移植细胞抑制四型胶原表达诱导大鼠黑质-多巴胺神经纤维再生

滕锡川，李洪鹏

【医药与卫生】

移植细胞抑制四型胶原表达诱导大鼠黑质-多巴胺神经纤维再生

滕锡川1，李洪鹏2

（1.辽东学院医学院，辽宁丹东，118003；2.中国医科大学 解剖教研室，沈阳110001）

为探索抑制中枢神经再生的分子机制和寻求诱导中枢神经损伤后再生的方法，将大鼠的黑质-纹状体多巴胺神经切断、局部移植嗅神经鞘细胞及脑膜纤维芽细胞。发现再生的神经纤维越过损伤部位伸向纹状体，移植细胞后损伤局部四型胶原的表达被抑制，而胶质性瘢痕以及硫酸软骨素的表达无明显变化。结果表明：纤维性瘢痕在阻碍神经再生的诸多因素中起到重要的作用；与脑膜纤维芽细胞相比，移植嗅神经鞘细胞对中枢神经损伤后的再生具有一定的诱导作用，为诱导神经再生提供了新的手段和方式。

中枢神经损伤；嗅神经鞘细胞；再生

成熟哺乳动物的中枢神经完全损伤后，很少出现神经轴突的再生。损伤局部影响神经轴突再生的主要因素是细胞外基质，包括不同类型的硫酸软骨素、tenascin和semaphorin3A等。这些因素中，局部形成以四型胶原（Col IV）为主的纤维性瘢痕，也是影响神经轴突再生的重要角色。如果在损伤局部投入四型胶原蛋白抗体或者DPG（一种四型胶原蛋合成抑制剂）可以减少局部纤维性瘢痕的生成，诱导大鼠前交叉神经的再生。笔者曾在生后1w的小鼠大脑实验中发现，损伤后神经再生的同时不伴有局部四型胶原蛋的产生［1］。

很多研究者尝试用细胞移植来诱导轴突的再生和功能的恢复，包括纤维芽细胞、雪旺细胞、神经干细胞和骨髓干细胞等基质细胞。近十年来，嗅神经鞘细胞（OEC）对神经再生的诱导作用受到广泛地关注。嗅神经具有损伤后轴突再生以及和嗅球构成新的神经突触的能力，此功能与包绕着嗅神经的神经鞘细胞作用密不可分［2］。有研究报道，移植嗅神经鞘细胞可以改变损伤部位的内环境，减少某些抑制神经轴突延伸的因素，诱导小鼠脊髓损伤后的神经再生。但其中的分子机制尚不明确［3］。

本研究将大鼠的黑质-纹状体多巴胺神经切断后局部移植嗅神经鞘细胞，观察其对局部神经纤维再生的诱导作用以及对纤维性瘢痕形成的影响，同时与移植脑膜纤维芽细胞（Fb）比较，观察两者对神经再生诱导作用的优劣。

1 材料和方法

1.1 黑质-多巴胺神经损伤的动物模型制作及分组

雄性SD大鼠8 w龄，体重250～300 g，用于本实验。大鼠以腹腔内注射戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，固定于立体支架的脑固定装置，切开头皮标记前囱，于距前囱1.5 mm后方、距正中1.0 mm右侧处用齿科钻去除颅骨、暴露大脑表面，用宽幅为2.0 mm的自制刀片横向垂直入脑7.0 mm，保留1 min后缓慢拔出。

对侧黑质-多巴胺神经作为无损伤组。

1.2 嗅神经鞘细胞和脑膜纤维芽细胞的取材和培养

用4 w龄雄性SD大鼠，从嗅神经细胞及嗅球层细胞分离出嗅球组织并剪成碎片，置入DMEM/F并加有10%胎牛血清培养液中，培养4～6 d，当细胞铺满培养皿后进行传代。12～18 d后以Hoeenst33342荧光标记细胞1 h，标记后的细胞用胰蛋白酶收集，用DMEM/F培养液清洗两遍，配成（5～8） ×107/mL细胞悬浮液备用；大鼠脑膜纤维芽细胞取材于大鼠的小脑脑膜，方法同前。嗅神经鞘细胞和纤维芽细胞分别以抗p75神经生长因子单克隆抗体和抗纤维连接蛋白多克隆抗体进行免疫组化鉴定确认。

此方法培养的嗅神经鞘细胞中，嗅神经纤维芽细胞（ONF） 约占30%。

1.3 移植嗅神经鞘细胞和脑膜纤维芽细胞

大鼠黑质-多巴胺神经切断后，迅速抽取2 μL OEC/ONF或Fb悬浮液（约1×105细胞），缓慢注射到损伤部位，对照组注射等量生理盐水。

1.4 制备组织切片

大鼠于术后2 w麻醉。组织取材后浸泡于固定液中24 h后行冰冻切片，厚度30μm，置于载玻片上，-20℃备用。

1.5 免疫组化实验

将切片置于3%H2O2和0.1%Triton X-100混合液中，室温15 min，以20 mmol/L（PBS） 缓冲液轻柔冲洗，切片上滴注下述抗体溶液，4℃过夜后加入生物素标记的二抗IgG（1∶100） 37℃、30 min，再分别加入二抗试剂，0.01%DAB显色。抗体来源、名称和体积分数见表1。

表1 抗体来源、名称及体积分数

1.6 神经纤维的量化分析

应用Carl Zeiss的KS400 3.0软件对神经纤维进行量化分析。每6张连续切片为一组（厚度为150μm），测定范围为距离损伤中心200μm。

2 结果

36只大鼠行黑质-纹状体多巴胺神经的单侧切断，其中7只损伤后注入生理盐水（对照组），19只于切断神经后移植嗅神经鞘细胞，另有10只大鼠神经切断后植入脑膜纤维芽细胞。各组大鼠均于术后2 w灌流取脑，所有大脑切片均行免疫组化染色，2 w后的脑切片作为神经纤维束的量化分析的样本。

2.1 损伤后局部纤维性和胶质性瘢痕的组织学变化

损伤后局部纤维性瘢痕的形成是阻碍神经再生的原因之一，而构成纤维性瘢痕的主要成分为四型胶原。有学者尝试抑制损伤部位胶原蛋白的形成，可诱导部分神经轴突的再生。本研究显示，对照组的大鼠，损伤2 w后局部形成空洞，同时可见四型胶原免疫阳性反应，框线部分放大后显示，四型胶原集中表达于损伤部位的中心，构成纤维性瘢痕的主要成分，同一切片未见Hoeches阳性细胞，提示无细胞移植。损伤后移植Fb或OECs/ONFs 2 w的大鼠切片上，四型胶原免疫阳性反应减弱，尤其移植嗅神经鞘细胞后明显抑制四型胶原的表达，且仅限于损伤部位血管的基底膜，中心部位未见四型胶原免疫阳性反应物聚集，同一切片中可见移植的细胞。（图1A-1I）

构成损伤后局部胶质性瘢痕的成分主要为神经胶质细胞产生的GFAP。对照组大鼠2w后见损伤部位外周出现明显的GFAP免疫阳性的表达，提示损伤后反应性神经胶质细胞增生；但在移植Fb或嗅神经鞘细胞OECs/ONFs的大鼠切片上，GFAP的表达无明显改变，反应性神经胶质细胞位于移植细胞周围，与对照组比较无明显差异。（图 1J-1L）

图1 损伤2 w后Col IV在损伤局部的表达

2.2 移植细胞对上行的黑质-纹状体多巴胺神经轴突再生的影响

黑质-纹状体多巴胺神经针对TH抗体进行免疫组化检测，对照组大鼠损伤后2 w切片可见损伤局部空洞形成，且上行的黑质-纹状体多巴胺神经轴突染色致密，而损伤部位远端未见黑质-纹状体多巴胺神经纤维，提示损伤后无黑质-纹状体多巴胺神经纤维的再生。脑膜纤维细胞移植组可见损伤局部空洞消失，部分黑质-纹状体多巴胺神经轴突伸入移植细胞的部位，并有少数神经纤维越过损伤部位伸向远端的纹状体，同时呈现蓝色荧光的移植细胞位于损伤部位。嗅神经鞘细胞移植组术后2w同样可见局部空洞消失，与纤维细胞移植组比较，可见较多的TH阳性神经纤维上行跨过损伤部位并延伸至纹状体，同时于损伤部位呈现蓝色荧光的嗅神经鞘细胞移植（图2A-2F）。

图2 损伤2 w后TH阳性神经纤维的再生情况

2.3 再生TH阳性神经纤维的定量分析

应用Carl Zeiss的KS400软件，对TH阳性神经纤维进行定量分析，各组2 w后切片分别测定。在无损伤组的切片中，上行的黑质-纹状体多巴胺神经数量为1 387±170（n=6），黑质-纹状体多巴胺神经切断且未移植细胞（对照组）的切片中，TH阳性神经纤维显著下降至98±15（n=6），移植纤维细胞组显示黑质-纹状体多巴胺神经数量部分恢复至230±25（n=6），但与未移植细胞的大鼠相比无显著性差异；移植嗅神经鞘细胞组大鼠TH阳性神经纤维的数量显著增加598±135（n=6），对照组大鼠相比有显著性差异（P＜0.01）（图 3）。

2.4 损伤局部硫酸软骨素蛋白聚糖的表达分析

图3 单位面积TH阳性神经纤维的分析

有文献报道，损伤后局部CS-D的增加，可影响神经纤维的再生。运用2.3量化分析的方法，观察到各组切片中CS-D的表达无显著性差异（图4），提示移植细胞后对CS-D的表达无明显影响。

图4 损伤局部CS-D的表达

3 讨论

中枢神经系统损伤局部由于组织液化坏死，导致空洞样病理结构形成，阻碍神经轴突再生。本研究发现，移植嗅神经鞘细胞和脑膜神经芽细胞可抑制损伤局部空洞样结构的形成，并在一定程度上诱导黑质-纹状体多巴胺神经部分再生。在移植嗅神经鞘细胞的切片上观察到再生的神经纤维延伸至纹状体结构，说明移植细胞不仅从形态学上消除了空洞的形成，还为神经轴突的再生搭建了一个桥梁，为神经再生创造了有利的内环境。

损伤后局部纤维性瘢痕的形成是阻碍神经再生的另一个重要原因，瘢痕中的主要成分为四型胶原蛋白。很多动物实验尝试抑制损伤部位四型胶原蛋白可以诱导部分神经轴突的再生。笔者曾观察到大鼠胎儿中枢神经损伤后，局部无纤维性瘢痕形成，且伴有神经轴突的再生。本研究显示，与对照组相比，移植嗅神经鞘细胞可明显抑制损伤局部四型胶原的表达（局限于再生的血管基底膜），且移植嗅神经鞘细胞组在诱导神经再生方面明显优于移植脑膜纤维芽细胞组，证实四型胶原的是抑制神经再生的细胞外基质之一。

神经胶质细胞为中枢神经系统提供重要的营养支持，常在损伤局部有明显的增生。本研究显示，各组切片均有不同程度的GFAP免疫阳性细胞增生，但与对照组相比，未呈现显著表达的迹象，显示移植细胞后未改变局部神经胶质细胞的增生情况，说明神经胶质细胞对神经再生无明显阻碍作用。有报道称CS-D可阻碍神经纤维的再生，而本研究显示，损伤后是否移植细胞无明显的CS-D表达的变化。

移植嗅神经鞘细胞可在损伤局部提供良好的细胞外环境，以利于神经再生。据报道，嗅神经鞘细胞具有多种抗原性和形态学特性，与神经胶质细胞、雪旺细胞、少突胶质细胞等有相似之处，同时可分泌多种细胞外基质，包括各种神经营养因子如BDNF和NT-3等［4］。本研究提示，移植嗅神经鞘细胞可通过抑制四型胶原的表达诱导神经再生，但其分子机制尚不明确。因此，嗅神经鞘细胞对细胞间信号的传导，以及在转录和翻译过程中对四型胶原表达的影响，尚需进一步研究。

［1］ TENG X C，NAGATA I，LI H P，et al.Regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons after transplantation of olfactory ensheathing cells and fibroblasts prevents fibrotic scar formation at the lesion site ［J］.JNeurosci Res.2008.86:3140-3150.

［2］ KAWANO H，LI H P，SANGO K.Inhibition of collagen synthesis overrides the age-related failure of regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons ［J］.JNeurosci Res，2005， 80：191-202.

［3］ LI H P，HOMMA A，SANGO K，et al.Regeneration of nigrostriataldopaminergic axonsbydegradationofchondroitin sulfate is accompanied by elimination of the fibrotic scar and glialimitansin thelesionsite ［J］.JNeurosciRes，2007，85:536-547.

［4］ BARNETTSC，RIDDELL JS.Olfactory ensheathing cells（OECs） and the treatment of CNSinjury:advantages and possible caveats ［J］.JAnat，2004，204 （1）：57-67.

Regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons by transplantating cells to suppress type IV collagen expression

TENG Xi-chuan1，LI Hong-peng2
（1.College of Medicine，Eastern Liaoning University，Dandong 118003；China；2.Department of Anatomy，China Medical University，Shengyang 110001， China）

The present study was designed to examine whether cell transplantation into a damaged central nervous system could promote axonal regeneration.Nigrostriatal dopaminergic axons were unilaterally transected in rats and cultures of olfactory-ensheathing cells（OEC） were transplanted into the lesion site.After 2 weeks,dopaminergic axons were shown regenerated across the transplanted tissues compared with the absence of transplants.Reactive astrocytes and chondroitin sulfate immunoreactivity increased around the transplants,whereasthedeposition of type IV collagen and fibrotic scar formation were completely prevented at the lesion site.The present resultssuggest that elimination of the inhibitory fibrotic scar isimportant for neural regeneration.

central nervous system；olfactory ensheathing cell；regeneration

R364.3

A

1673-4939（2017）04-0246-06

10.14168/j.issn.1673-4939.2017.04.04

2017-06-28

辽东学院博士科研启动基金项目（8804901）

滕锡川（1967—)，男(回族)，辽宁丹东人，博士，副教授，研究方向：中枢神经的再生机制。

（责任编辑：鞠衍清）