利用镧系金属探针的顺磁及发光特性研究蛋白质相互作用

吴 桐

（浙江外国语学院科学技术学院，浙江 杭州 310023）

在细胞信号传导、细胞迁移、基因表达等多项生理活动中，都会发生蛋白质相互作用。所以在生命科学研究中，需要对蛋白质相互作用进行深入研究。但从实践情况来看，采用传统核磁共振、荧光检测等技术进行蛋白质相互作用观察，容易遭遇蛋白质标记问题，需要借助镧系金属探针特性加强蛋白质标记，从而得到科学的研究结果。

1 镧系金属探针的顺磁及发光特性

作为稀土元素，镧系金属中的钆元素带有显著的顺磁特性，铽元素则具有较好发光特性。钆离子拥有半充满f轨道和各向同性g张量，自旋量子数较大，同时拥有较长弛豫时间[1]。利用顺磁探针提供的未配对电子与核间相互作用，可以加快弛豫速率，同时不会引起交叉相干弛豫，能够提供简单的数据分析过程。借助溶液核磁共振技术，能够使钆的顺磁弛豫得到增强，从而对蛋白质复合体进行标记。在核磁共振实验中，顺磁弛豫增强的大小与电子和核间距离成正比关系，电子拥有较大磁矩，能够实现长距离监测，因此能够用于研究蛋白质相互作用。铽的发射谱在可见光区域内，荧光寿命达毫秒级。采用荧光波谱学技术，可以实现时间延迟检测，将纳秒量级背景荧光去除，从而使铽成为发光探针对蛋白质特异性进行标记，使荧光技术在蛋白质特异性检测上的不足得到弥补[2]。针对分子量较大的蛋白质，采用核磁共振等技术难以实现结构解析。利用铽探针进行蛋白质标记，能够对蛋白质结构、装配和动态变化进行分析，因此可以实现蛋白质相互作用的研究。

2 利用镧系金属探针研究蛋白质相互作用

（1）利用钆探针研究蛋白质相互作用。在对蛋白质相互作用展开研究时，利用钆探针顺磁特性，通过增强顺磁弛豫能够提供距离信息约束，实现蛋白质结构系综优化精修，对生物大分子复合体瞬时构象进行观测，确定蛋白质间发生的相互作用。采用该方法，能够获得较之电子质子更短的基态结构，得到低分布频率构象，因此能够对蛋白质相互作用进行动态研究。在研究大肠杆菌磷酸转移系统时，细胞信号传导需要通过蛋白质磷酸化作用实现。但是从生物信息学角度来看，在数以万计蛋白质间，仅几千个蛋白质复合体能够获得原子水平分辨率结构信息，其中能够实现信号传导的则更少。针对蛋白质复合体拥有较高分辨率结构信息的特征，需要采用钆探针实现核磁共振实验中顺磁弛豫增强，对弱相互作用遭遇的蛋白质复合体进行检测，从而得到相应结构信息。

实验需要以大肠杆菌基因为模版实现定点突变，利用非同位素进行蛋白表达纯化，然后实现核磁共振滴定。在整个过程中，酶I（EI）C末端结构域内，需要对磷酸烯醇式丙酮酸的水解作用进行催化，促使其N端结构域（EIN）实现自动磷酸化，将基团传递至组氨酸磷酸运载蛋白，最终传递至酶IIA（EIIA）。研究EI与EIIA间发生的相互作用，可以进行二者间核磁共振滴定实验，利用钆探针在EIIA突变体和D144C突变体中进行钆离子的引入。通过研究发现，EI和EIIA间平衡解离常数约13mM，说明二者之间存在较弱相互作用，能够证明EI和EIIA间并非直接相互作用。通过对磷酸化酶促反应进行测定可以发现，EIIA能够被EI直接磷酸化，缺失突变体的酶则会对这一过程进行抑制，因此可以说明Hpr酶未参与到磷酸化过程中。在实验期间，能够检测发现EI-EIIA复合体的存在，但是存在时间和比例均较少。由此可见在蛋白质间发生极弱相互作用时会对复合体进行遭遇，但在各种因素调节下能够达到结合与解离间的平衡，保证细胞信号顺利传播。

（2）利用铽探针研究蛋白质相互作用。实际上，细胞中各种生理活动需要利用不同信号通路实现，各通路之间会发生交叉对话。蛋白质作为细胞信号传导网络的节点，需要通过相互作用实现信号传递。采用荧光技术，可以利用荧光分子间能量转移现象进行蛋白质相互作用研究，即根据荧光分子发射光谱和受体间光谱重叠情况确定距离约束信息，对蛋白质动态学信息进行获取。但是由于生物样本自发荧光，采用有机小分子探针对蛋白质进行标记会出现非特异性问题。采用铽探针，可以通过电子自旋禁阻轨道跃迁发光，只有较小的发光系数，能够利用有机生色基团进行能量转移，在紫外激发下发出绿光，从而通过扣除纳秒级荧光寿命实现蛋白质特异性检测。在活细胞中，利用有色氨酸的结合标签，能够使铽离子与目的蛋白质融合。标签中的天冬氨酸等可以与铽离子构成稳定配位化学键，实现蛋白质的特异性标记。

在研究半胱氨酰白三烯受体CysLTR时，可以在基因中不同位点进行结合标签突变质粒的插入，利用数据库对氨基酸序列展开分析。由于其是细胞膜外N末端进行的多次跨膜蛋白，通过插入结合标签，能够使N末端和膜外loop环对铽离子进行结合，实现受体标记。利用标记的hCysLTR对转染细胞进行刺激，可以借助标记物中激动剂白三烯D4实现，然后对细胞内钙增高情况进行测定。从研究结果来看，利用含结合标签的质粒进行细胞转染后，相较于野生型受体，得到的受体不会出现细胞内钙增高的情况。在结合标签与hCysLTR之间进行甘氨酸的插入，能够实现柔性链接。从细胞内钙的检测结果来看，依然无反应，可知增加柔性链接长度无法产生刺激作用。由于铽的激发波段为紫外，不利于生物样本观察，因此可以引入喹诺酮，采用更长波长实现激发。

采用光学显微镜成像法进行观测，可以发现铽离子对细胞形态和活性不会产生显著影响。利用多光子显微镜进行铽标记的蛋白观察，可以发现标记的蛋白质和未标记的蛋白质都发出了微弱荧光，与细胞自发背景荧光被激发有关。对微妙延迟检测时间进行设置可以发现，未插入结合标签的蛋白质荧光完全消失，但是利用铽标记特异性蛋白质依然发光。由此可见，在膜外loop区蛋白质标记检测方面，可以采用铽探针对蛋白质相互作用进行研究。采用该方法，利用多功能酶标仪进行细胞观察，可以发现铽离子对蛋白质做出的特异性标记。

3 结论

通过研究可以发现，在蛋白质相互作用研究领域，采用传统的荧光检测技术和核磁共振技术容易遭遇蛋白质标记问题。而对镧系金属探针进行运用，能够借助钆探针顺磁特性和铽探针发光特性实现蛋白质特异性标记，为研究蛋白质相互作用提供支持。因此在实践工作中，还应加强镧系金属探针特性分析，以便实现探针合理利用，满足蛋白质相互作用研究需求。