1例复发性流产患者甲状腺相关基因多态性及受体表达

陈馨蕊 赵小玉 李淑英 曹 鹏 杨 华* 姚小梅

1.天津医科大学(300070)；2.天津市中心妇产科医院

1 临床资料

女，31岁，孕2产0。患者停经2月余，无明显诱因腹痛伴阴道出血1d入院。妇科检查见子宫增大如孕50d，双附件未及明显异常。B超检查示提示，宫内早孕，孕卵停育，先兆流产。患者婚后2年，自然妊娠2次，第1次为16个月前出现生化流产。患者既往体健，平素月经规律，有痛经史，否认遗传家族史。入院后行人工流产术。妊娠期间人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)正常，术前末次检测为69 574 U/L。甲状腺功能检查均正常(血清游离三碘甲状原氨酸(FT3)4.7pmol/L；血清游离甲状腺激素(FT4)12.6 pmol/L；促甲状腺激素(TSH)1.986mU/L；甲状腺球蛋白抗体1.9 U/ml。空腹血糖正常，弓形虫抗体TOX-IgG、风疹病毒抗体RV-IgG、巨细胞病毒抗体CMV-IgG、单纯疱疹病毒HSV-II-IgG 、滴虫检查、霉菌检查均阴性。

经患者同意并签署知情同意书后，取患者流产绒毛组织提取DNA，并使用Illumina高通量测序平台(HiSeq/MiSeq)进行全外显子测序。数据分析：获得的有效测序数据，通过BWA(Li H et al.) 和Samblaster比对到参考基因组(B37)，获得SNP位点信息，并利用ANNOVAR(Wang K et al.)软件对SNP位点进行注释，包括SNP位点的基因结构注释、基因组特征注释、非同义突变有害性预测、已知变异数据库注释、变异相关基因功能注释。最终得到了22423个SNP位点和1458个InDel位点。对甲状腺激素受体(THR)分析，发现甲状腺激素受体α基因在染色体17(17q21.1)有4个SNPs位点(rs1402030G>C、rs67228062T>A、rs939348T>C、rs9893741T>C)，THRB在染色体3(3p24.2)有7个SNPs位点(rs138578441CT>C、rs142996757G>GTTTCCTTTCATTTCC、rs1667743C>A、rs1667765T>C、rs372912060C>T、rs3836253G>GA、rs7642896G>C)，均位于内含子区域。除THR外，与甲状腺激素合成相关的基因：促甲状腺激素受体(TSHR)基因存在13个多态位点，其中3个位于外显子区域SNPs位点(c.A696G:p.L232L、c.C742A:p.R248S、c.G2181C:p.E727D)；甲状腺过氧化物酶(TPO)基因存在36个SNPs位点，其中7个位于外显子区域SNPs位点(c.C12G:p.L4L、c.G1117T:p.A373S、c.G1193C:p.S398T、c.C1998T:p.D666D、c.C2145T:p.P715P、c.A2173C:p.T725P、c.T2408C:p.V803A)。双氧化酶2(DUOX2)基因存在5个SNPs位点，其中3个位于外显子区域SNPs位点(c.C3200T:p.S1067L、c.G1461C:p.G487G、c.C413T:p.P138L)。DUOXA2基因存在1个位于外显子区域SNPs位点(c.C298G:p.R100G)。TRHR基因存在1个位于内含子区域SNPs位点。未发现TTF-1、TTF-2、PAX8、NIS基因SNPs位点。为了进一步探讨此例复发性流产绒毛甲状腺激素受体蛋白的表达，将此例复发性流产(RSA)病例的绒毛与15例非RSA病例进行了流产绒毛的免疫组化染色与Western-blotting分析比较。发现THRβ1主要在胎盘绒毛基底膜上的细胞滋养层细胞(CT)表达，而位于表面的合体滋养层细胞(ST)表达较少，与非RSA患者相比，unexplained RSA患者THRβ1在胎盘绒毛中的CT以及ST表达均显著下降(P<0.05)。Western-blotting 获得的结果与免疫组化结果一致。

2 讨论

Li等[1]对于中国汉族人群进行研究，研究包括200名不明原因复发性流产患者和200名正常对照。通过对其流产绒毛组织进行测序发现miR-10a(非编码小RNA，通过碱基对对目标mRNA的部分互补位点进行降解或翻译抑制调控基因表达)位点上出现的rs3809783 A>T的多态改变通过破坏成熟miR-10a的产生，促进复发性流产的遗传易感性。Abdollahi等[2]对200名复RSA患者及200名健康对照的病例对照研究发现，RSA患者的IL-23受体(R381Q)SNPs频率较正常对照组低。Arjmand等[3]的病例对照(病例组117个，对照组117个)研究显示，位于HLA-G基因(人类白细胞抗原-G，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞)上的SNP HLA-G*0105N可以通过与其他基因组件的连锁不平衡导致复发性流产。Fan等[4]对1284位中国汉族RSA患者的胎盘绒毛进行测序，并与1046正常对照(至少成功妊娠1次)进行对比，发现CLTA-4/Foxp3基因多态(rs231775 A>G, rs3087243 G>A, rs2232365 A>G, rs2232368 G>A)与RSA的发生有关。全外显子测序(WES)在RSA病因研究中应用广泛。研究表明，有2/3的早期胚胎异常和1/3的胎儿异常与染色体异常有关[5]。Filges等[6]对1名有家族遗传倾向的RSA孕妇患者(G18P0，均为自然流产，其母G20P2)胎盘绒毛组织进行全外显子测序。WES显示在这个家庭中存在PLCD4(磷脂酶C δ4)(2,219501020,1,T/C)和OSBPL5(羟甾醇结合蛋白5)(11,3123481,1,C/G)基因SNP位点，这与卵母细胞成熟、活化和受精过程有关。

本例复发性流产测序发现TSHR、TPO、DUOX2及DUOXA2的多态性可能导致胎儿甲状腺发育异常或甲状腺激素合成障碍。TSHR在外显子区域SNPs有3个位点，编码TSHR的基因位于14号染色体长臂上(14q31)，其中c.A696G:p.L232L、c.C742A:p.R248S在OMIM数据库(https://www.omim.org/)中提示，不排除与自身免疫性甲状腺功能亢进，非自身免疫性甲状腺功能亢进，甲状腺功能减退及先天性甲状腺功能减低有关。TSHR基因编码的蛋白对于甲状腺细胞的增殖分化以及功能有重要影响，在甲状腺形态发育中起关键作用。

本例RSA测序发现TPO基因在外显子处有7个SNPs位点，编码TPO的基因位于2号染色体短臂上(2p25)，TPO基因多态性引起的遗传缺陷可导致人群中的甲状腺功能障碍，也是导致先天性甲状腺功能减低的因素，对于胎儿则会影响甲状腺的发育和中晚期甲状腺激素的合成。编码的甲状腺过氧化物酶主要负责碘化物氧化、有机化作用和碘化酪氨酸连接[7]。其中c.A2173C:p.T725P是与成年甲状腺功能减退症高度相关的等位基因，而携带c.C1998T:p.D666D等位基因的人群患甲状腺功能减退症的风险下降[8]。在我国c.C1998T:p.D666D、c.C12G:p.L4L、c.T2408C:p.V803A位点的等位基因及基因型频率分布，在先天性甲状腺功能减退症患儿和健康儿童间分布差异无统计学意义，认为可能不是先天性甲状腺功能低下的主要致病基因[9]。本例发现的位于外显子的c.G1117T:p.A373S、c.G1193C:p.S398T、c.C2145T:p.P715P多态尚未见报道。

笔者发现3个DUOX2位于外显子区域的SNPs位点，编码DUOX2基因位于15号染色体长臂上(15q15.3)，长度为22kb，是甲状腺激素碘有机化过程中的重要调控基因[10]；编码DUOXA2基因位于15号染色体长臂上(15q21.1)，DUOXA2基因突变被认为是先天性甲状腺功能减退症患儿的可疑致病因子[11]，DUOX2/DUOXA2在甲状腺的发育中起到重要作用，其异常会影响H2O2的合成，进而影响TPO的碘有机化过程，从而导致甲状腺激素合成障碍[12]。其中c.C413T:p.P138L被认为和永久性的甲状腺功能减退症有关[13]；c.C413T:p.P138L及c.C3200T:p.S1067L在先天性甲状腺功能减退症患者中出现的频率高于正常人群[14]。c.G1461C:p.G487G为可疑致病突变[15]。虽然本例测序发现的第3个SNPs位点rs2576090尚未见报道，但不能排除其对甲状腺发育及功能的影响。

虽然本例RSA病例发现THRA和THRB上的SNPs位点均位于内含子区域，并不能产生功能性蛋白，但不能因此除外其通过调节下游转录等过程影响功能。Hayashi[16]在一项病例对照研究中发现，rs1050606位点的等位基因频率在RSA患者和对照组中差异有统计学意义；且首次运用该多态性位点来评估RSA患者的妊娠结局。另外有研究者应用垂体细胞系的体外研究定义了THRB2亚型中的基础启动子区域。在评估启动子在体内的功能时，Jones等[17]发现了一个保守的有600碱基对的内含子区域，它起着增强子的作用，改变了垂体和视网膜细胞中THRB2亚型的表达。Alberobello等[18]证实了这个内含子增强子区域(ICR)的多态性可以调节突变的THRB等位基因的垂体表达，从而影响临床表现。2011年N Engl J Med报道，甲状腺激素水平在正常临界值的6岁儿童，出现甲状腺功能减退症状(发育迟缓，骨骼发育不良等)，生长发育明显落后于同龄人群，通过基因测序及基因多态性功能分析，发现THRA基因存在无义突变(c1207 G→T, p.E403X)，该突变可产生抑制野生型受体作用的突变蛋白，导致患者出现甲状腺功能减退症状，从而导致患者发育迟缓[19]。在妊娠前3个月，胎儿对甲状腺激素的需求主要依赖于通过胎盘转运至胎儿的母体甲状腺激素，因此，关注甲状腺激素受体的表达同样重要。

笔者发现，unexplained RSA患者较non-RAS人群THRβ1在胎盘绒毛表达显著降低，这与Ziegelmuller等应用免疫组化研究结果相一致[20]，而且发现：复发性流产患者胎盘绒毛THRβ1表达下降在细胞滋养层细胞较合体滋养层细胞更显著。

本例复发性流产不排除TSHR、TPO、DUOX2及DUOXA2的多态性导致胎儿甲状腺发育异常或甲状腺激素合成障碍，从而导致不良妊娠结局。此外，流产绒毛的 THRβ1在胎盘绒毛表达显著降低，母体正常的甲状腺激素与胎儿表达下降的甲状腺激素受体结合，可导致甲状腺激素功能不能正常发挥，最终导致胎儿生长发育异常和流产。