ERK1/2和NF-κBp65在EMs模型大鼠内膜中的表达及意义

王 芳 李咏梅 商丽红 杨玉娥 陈 华 哈春芳,3*

1.宁夏医科大学临床学院(银川，750004)；2.宁夏医科大学总医院；3.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室

子宫内膜异位症(EMs)是育龄期妇女的一种常见且复杂的慢性炎症性全身性系统性疾病。据报道，其发病率在育龄女性中占6%～10%，在不孕的妇女中增加到50%，临床主要表现为盆腔疼痛、痛经和不孕[1-2]。EMs发病机制目前仍主要基于Sampson最早提出的“经血逆流学说”，但却无法解释育龄期女性中仅8%～10%的发生率，这表明EMs的发生还与其他因素有关[3-4]。研究发现，炎症、卵巢类固醇激素失调、增殖侵袭相关分子及相应的信号通路间复杂的相互作用可能在EMs的发病机制中起着重要作用[5-6]。细胞外调节蛋白激酶(ERK)可将细胞外刺激信号传递至细胞内，通过整合多个细胞内信号模块参与调节肿瘤发生的许多细胞过程，包括调节细胞增殖、侵袭、迁移和转移等[7]。核因子κB(NF-κB)是多种信号通路的中枢元件和重要的转录因子。在调节机体免疫炎症反应和细胞增殖、迁移侵袭及多种肿瘤转移的过程中都起着重要作用，越来越多的证据显示NF-κB的异常活化参与了EMs发生的多种病理生理过程，但促使其活化转录并发挥生物学作用的具体机制仍不清楚。有研究报道，NF-κB在肿瘤中的激活可能是某些环节发生异常导致上游调节因子如MAPK/ERK途径的激活而实现[8-10]。因此本研究建立EMs大鼠模型，通过免疫组织化学法及Western blot法检测EMs大鼠在位内膜及异位内膜组织中ERK1/2、NF-κBp65及增殖侵袭相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达，探讨ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs发生发展中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级健康雌性未孕SD大鼠20只，6～8周龄，体质量(200±20)g，购自宁夏医科大学实验动物中心。自由光照，常规饲养。本研究方案得到了宁夏医科大学动物实验伦理委员会的批准。

1.2 主要实验试剂

兔多克隆抗体ERK1/2(ab17942)购自英国Abcam公司，兔多克隆抗体NF-κBp65(AF0874)购自Affinity公司、兔多克隆抗体PCNA(24036-1-AP)及MMP9(27306-1-AP)均购自武汉三鹰公司。免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购置于北京中杉金桥公司，BCA蛋白提取试剂盒和蛋白检测试剂盒购自凯基公司。

1.3 方法

1.3.1实验动物模型构建所有大鼠适应性喂养1周，采用自体移植法建立EMs大鼠模型[11]。所有大鼠均用1%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部备皮常规消毒，距尿道口上方1cm处纵行开腹，切口长约2cm，逐层分离肌肉、腹膜进腹，在膀胱后面提起分离左侧子宫，分别在距离卵巢及宫角分叉处约1cm处结扎，剪下长约1.5cm的左侧子宫放入生理盐水中，分离子宫内膜组织，将其剪成5mm×5mm大小的4块，分别用6-0无菌丝线缝合固定于左右侧腹壁血管丰富处，内膜面面向腹壁，3-0无菌丝线逐层缝合腹腔关腹。术后肌注青霉素3d预防感染。造模4周后，第2次剖腹检查异位病灶生长情况。造模成功标准：见异位病灶呈囊性增大，形成内含淡黄色清亮或者咖啡色液体，表面及周围可见血管形成。分别留取对照组在位内膜组织及EMs模型组大鼠在位及异位病灶组织随机分为两部分，一部分4%多聚甲醛中固定行石蜡包埋切片染色；一部分留置-80℃冰箱保存，用于Western blot蛋白检测。

1.3.2 HE染色术后4周第二次剖腹并处死大鼠，取EMs模型组大鼠在位及异位内膜组织与对照组在位内膜组织，室温下置于4%多聚甲醛液中固定48h，并常规进行石蜡包埋后组织切片(5μm)，经脱蜡复水，苏木素染核(5min)，分化液分化(10s)，返蓝液返蓝(10s)，伊红染色(5min)，梯度酒精脱水(70%-80%-90%-100%I-100II酒精各3min)，二甲苯透明(3min)，中性树胶封片后显微镜下观察各组内膜组织病理学变化。

1.3.3免疫组织化学染色将固定包埋好的蜡块切成5μm的切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、柠檬酸钠缓冲液微波抗原修复，内源性过氧化物酶阻断灭活(3%过氧化氢溶液室温避光猝灭15 min)，用山羊血清封闭(室温封闭60min)，一抗ERK1/2(1:200，ab17942,Abcam)、NF-κBp65(1:100，AF0874，Affnity)、PCNA(1:200, 24036-1-AP, proteintech)、MMP9(1:200,27306-1-AP,proteintech)4℃孵育过夜，第2天室温孵育45min，PBS洗涤，滴加抗兔二抗覆盖组织，室温孵育60min，显微镜下观察DAB染色情况，苏木素染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜下观察各因子表达定位情况。

1.4 Western blot蛋白检测

取大鼠在位及异位内膜组织置于液氮中保存，充分研磨，按照BCA蛋白提取试剂盒和检测试剂盒说明提取总蛋白并测定蛋白浓度。每个加样孔上样20μg 蛋白，电泳、PVDF膜转膜2h，再经5%脱脂牛奶室温封闭3～4h，一抗 ERK1/2(1∶1000，ab17942，Abcam)、NF-κBp65(1:1000，AF0874，Affnity)、PCNA(1:1000,24036-1-AP,proteintech)、MMP9(1:500,27306-1-AP,proteintech)、β-actin(1∶5000，AF7018,Affnity)4℃摇床孵育过夜。次日室温孵育1h，TBST漂洗，加抗兔二抗(1∶10000)，TBST 漂洗，加适量ECL增强液于PVDF膜上放置，在BIO-RAD成像仪中显影曝光，以β-actin为内参，采用Image J软件对目的条带进行扫描分析，根据曝光结果计算蛋白相对表达量。

1.5 统计学处理方法

所有实验数据均使用GraphPad Prism 7统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，两样本比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA分析，Pearson相关分析分析各因子间的相关性，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EMs模型大鼠组织病理学鉴定

可见异位病灶组织呈囊状增大，内含淡黄色清亮或者咖啡色液体，表面及周围可见血管形成；HE染色异位病灶组织见子宫内膜腺上皮细胞呈柱状生长，内可见多个大小不等的腺体及间质炎症反应，间质内可见新生血管形成，即为模型建立成功。见图1(245页)。

2.2 ERK1/2及NF-κBp65在内膜组织中的表达

免疫组化结果显示，ERK1/2在EMs在位及异位内膜的腺上皮细胞及腺体胞浆中均有表达。NF-κBp65在EMs在位及异位内膜的腺体、间质及腺上皮细胞的胞浆中均有表达，胞核中也有少量表达，见图2，3(245页)。 Western blot结果显示，与对照组相比，模型组在位及异位内膜组织中ERK1/2、NF-κBp65蛋白表达水平增高，且异位内膜组织中的表达水平高于在位内膜组织(P<0.05)。见表1，图4(245页)。

表1 各组内膜中ERK1/2及NF-κBp65蛋白表达水平的比较

2.3 RK1/2与NF-κBp65表达水平的相关性分析

Pearson 相关分析显示，EMs在位内膜组和异位内膜组中，ERK1/2与NF-κBp65的表达水平均呈正相关(异位内膜组r=0.657，P<0.05；在位内膜组r=0.709，P<0.05)，见图5(245页)。

2.4 内膜组织中PCNA、MMP9蛋白表达及表达水平

免疫组化结果显示，PCNA在EMs在位及异位内膜的腺体及腺上皮细胞胞核及胞浆中均有表达。MMP9在EMs在位及异位内膜的腺体、间质及腺上皮细胞中均有表达，且主要表达于腺体和间质的胞浆中，胞核中也有少量表达。见图6，7(246页)。Western blot结果显示：与对照组相比，EMs模型组在位及异位内膜组织中PCNA、MMP9蛋白表达水平增高，且异位内膜组织中 PCNA及MMP9蛋白表达水平高于在位内膜组织(P<0.05)。见表2，图8(246页)。

表2 各组内膜中PCNA及MMP9蛋白表达水平的比较

3 讨论

EMs虽在病理形态学上属于一种良性病变，但其异位内膜的种植却涉及增殖、迁移侵袭、转移等恶性生物学特性。近年来研究表明，多种细胞因子(增殖、侵袭相关因子)的活化表达参与了EMs的发生发展。因此本实验采用自体移植法诱导建立EMs大鼠模型，旨在探讨ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs发生发展中的可能作用。

ERK 作为MAPK传导途径中的末端主激酶，包含ERK1和ERK2两种亚型，受细胞外炎症因子刺激并由其上游激酶MEK磷酸化激活，通过磷酸化作用机制调节NF-κB 等多种转录因子的活性和基因表达，最终在调控与细胞增殖、侵袭相关基因的转录表达中发挥特定的生物学效应[12-14]。文献报道，EMs患者腺上皮细胞和间质细胞中ERK1/2表达及磷酸化活化程度明显增高，提示其可能在EMs发生发展中发挥重要作用[15]。Arosh等[16]通过体内外实验证实，EMs中ERK1/2途径的抑制降低了体外人子宫内膜异位基质细胞的增殖和生存活力以及体内EMs小鼠模型中子宫内膜异位病变的生长，揭示MAPK / ERK途径的过度激活对子宫内膜异位病变的增殖、存活和生长的重要性。本研究建立EMs大鼠模型，Western-blot检测结果显示 EMs大鼠在位及异位内膜组中ERK1/2蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，且与对照组相比，EMs大鼠在位及异位内膜组中PCNA蛋白表达水平亦增高。进一步揭示ERK1/2途径的过度激活增加与EMs的发生发展密切相关，其可能通过增强异位内膜的增殖能力促进EMs的发生发展。

NF-κB是由NF-κBRel蛋白家族中的两个亚单位P50和p65构成的二聚体复合物。作为备受关注的多种信号通路将细胞外刺激信号转化为转录程序的重要枢纽，在正常和病理条件下调节细胞信号，静息状态下NF-κB多以惰性复合物的形式与IKBa结合存在于多种细胞类型中，当细胞受到各种细胞外刺激后，活化的NF-κB与其复合物IKBa解离并进入细胞核，参与调节机体免疫炎症反应、细胞增殖侵袭等多种生物学效应[17-18]。EMs患者异位组织中NF-κB激活的增加表明它可能在EMs的发病机制中起作用。据报道，NF-κB作为EMs的重要转录调节因子，NF-κB的过度活化参与了EMs发生发展过程中炎症、免疫等多种病理生理过程[19-20]。研究表明，NF-κBp65在EMs患者的在位及异位内膜组织中表达增高，NF-κBp65 siRNA干扰EMs原代腺上皮细胞后发现其侵袭性相应减低，揭示NF-κBp65的过度激活可能是介导EMs异位细胞侵袭性增强的关键[21-22]。本研究结果显示：与对照组相比，EMs大鼠在位及异位内膜组织中NF-κBp65蛋白以及MMP9蛋白的表达水平升高，揭示NF-κBp65在EMs中过度激活增强了异位内膜的侵袭能力，可能是EMs发生及演变过程中的关键基因，但EMs中活化NF-κBp65表达增强异位细胞侵袭性的具体上游机制仍不清楚。

分子生物学研究显示，在调节细胞生长过程中NF-κB作为ERK的直接下游靶点发挥着举足轻重的作用，它可以引发一系列的抗凋亡基因，并在多个水平上阻断凋亡级联反应[23]。肿瘤学研究发现，NF-κB在肿瘤中的激活可能是通过炎症刺激如肿瘤坏死因子α(TNFα)或通过上游调节因子如MAPK/ERK途径激活实现，最终导致肿瘤细胞的增殖侵袭[24-25]。本实验建立EMs大鼠模型，免疫组化及Western-blot结果均证实：与对照组相比，ERK1/2与NF-κBp65在EMs大鼠在位及异位内膜中表达水平升高，且呈二者表达呈正相关，进一步检测增殖、侵袭相关蛋白(PCNA、MMP9)表达，结果亦表明与对照组相比，EMs模型组异位病灶增殖侵袭性明显增强，进一步通过体内动物实验证实两者的表达与EMs的发病息息相关，二者表达水平升高可能通过增强异位病灶组织的增殖侵袭能力，促进了EMs的发生发展。

综上所述，本研究表明ERK1/2与NF-κBp65在EMs大鼠内膜组织中表达增高且呈正相关，揭示二者作为信号通路中的关键靶点与EMs的发生紧密相关，可能是诱导EMs发生的关键基因，下一步将继续利用EMs大鼠为研究模型并靶向抑制ERK1/2蛋白，检测靶向治疗后异位病灶体积变化，通过体内动物实验明确ERK1/2与NF-κBp65表达在EMs发病中的作用，为EMs的药物靶向治疗提供可靠的理论和实验依据。