角化细胞生长因子及受体在产后出血致肾脏缺血再灌注妊娠大鼠中的表达

施旭婷 贾瑞喆

1.南京医科大学附属常州第二人民医院(213000)；2.南京医科大学附属妇产医院

产后出血是孕产妇死亡第一大原因，出血量较大时产妇易发生失血性休克，此时会出现组织灌注减少，发生无氧代谢，体内血液乳酸含量迅速增高并发生代谢性酸中毒，血液将再次分布以保证脑部和心脏的血液供应，但会促进血管的再次收缩，对细胞造成损伤导致体液、蛋白丢失，恶化缺血情况，发生多器官衰竭[1]。随着动脉搭桥、溶栓、心脏外科体外循坏、心肺脑复苏等技术的应用，组织器官缺血后通过再灌注多数能够重建功能并恢复损伤，但存在少部分患者再灌注后出现损伤加重，为缺血性再灌注损伤(IRI)，其中肾脏损伤首当其冲[2]。一些研究提到角化细胞生长因子及其受体(KGF、KGFR)指标一定程度反映了缺血再灌损伤(IRI)的进展，徐苗苗[3]等研究显示，α-MSH具有抗炎、退热、抗菌、调节能量平衡及心血管功能的作用，对肾脏的缺血/再灌注损伤有一定保护作用；Bertolini[4-5]等研究对这一理论进行了证实。近年来，关于IRI损伤后的修复成为研究热点，KGFR是KGF的受体，在肾、肺脏器等细胞膜表面具有特异性表达，KGFR与KGF结合具有促进上皮细胞增生、分化、损伤修复等作用[6]。本研究探讨了KGF及其受体在产后出血致肾脏缺血再灌注妊娠大鼠中的表达及其保护作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1实验动物选取妊娠足月(孕20d)SD大鼠90只，均为医科大学实验动物室提供，饲养温度18～22℃，相对湿度65%～70%，自由饮水，定时定量投放清洁鼠粮喂养。

1.1.2实验试剂及仪器①北京华迈科生物技术公司α-MSH；②美国圣路易斯Sigma-Aldrich化学品公司KGF；③加利福尼亚Santa Cruz 生物技术公司KGFR抗体；④Shimadzu公司Heraeus Picol 17离心机；⑤杭州诺扬生物技术有限公司超纯RNA提取试剂盒、cDNA试剂盒；⑥无创血管夹、干燥箱、低温冰箱、振荡仪等。

1.2 方法

1.2.1模型及分组将90只大鼠分为生理盐水组、α-MSH组和对照组各30只。生理盐水组、α-MSH组建立大鼠产后失血性休克再灌注模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，常规消毒处理后做下腹部正中切口暴露子宫，切开大鼠子宫、孕囊，取出胎鼠后缝合子宫并逐层关闭。剖腹手术完成后于髂总动脉分叉处上方0.5 cm处用无创动脉夹夹闭腹主动脉30 min，然后松开动脉夹再灌注60 min，造成子宫缺血再灌注模型。对照组下腹部正中切口打开腹腔，充分暴露子宫、孕囊，取出胎鼠后缝合子宫，逐层关闭，不进行夹闭动脉。α-MSH组腹腔注射α-MSH 0.5ml/kg及少量生理盐水使总注射量达4ml，其余两组注射4ml生理盐水。

1.2.2标本所有大鼠在造模完成后留取尿液标本，记录尿量、尿渗透压(OSM)，12h后完成血样标本采集即终结大鼠生命，开胸取右肺、右肾组织用于RT-PCR检测，液氮中快速冷冻，-80℃冰箱保存；注射器穿刺心脏取1.5ml心脏血液静置，离心处理后取血清置于EP管-20℃保存。生化分析仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。

1.2.3RT-PCT检测KGF上游引物5-GAGGGACACACGAGAAGTTATGAC-3，下游引物5-CATTTAGCTGATGCAGAGGTGTTG-3，产物大小320bp。KGFR上游引物5-GCATGGTTGACAGTTCTGCCAG-3，下游引物5-CGCTTCAGCCATGACTACTTGC-3，产物大小420bp。

1.2.4肾、肺含水量检测摘除大鼠右肺、右肾用生理盐水重复洗净后矢状切开，吸除血液称得湿质量，放入烤箱充分烘干后称得干质量，使用干湿重法计算肾、肺组织干湿比。

1.3 观察指标

观察对比大鼠肺组织病理改变、肾功能情况及KGF mRNA、KGFR的平均光密度、实时定量水平。

1.4 统计学方法

将数据纳入SPSS21.0分析，多组计量资料比较采用F检验，两两比较采用Newman-Keuls检验，水平间均值差异较微小使用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尿量、OSM、Scr及BUN对比

3组大鼠中，生理盐水组尿量、Scr、BUN水平高于另两组，尿渗透压低于另两组，α-MSH组尿量高于对照组，尿渗透压低于对照组(P<0.05)，但两组Scr、BUN水平无差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠尿量、OSM、Scr及BUN对比

2.2 各组大鼠肾、肺含水量

3组大鼠肾、肺含水量，生理盐水组最高，α-MSH组次之，对照组最低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾、肺含水量对比

2.3 各组大鼠肾、肺组织KGF mRNA表达水平

3组大鼠肾、肺组织中均能表达KGF mRNA，生理盐水组表达水平最低，α-MSH组次之， 对照组最高(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾、肺组织KGF mRNA表达

2.4 各组大鼠肾、肺组织KGFR表达

3组大鼠肾、肺组织KGFR平均光密度、实时定量，生理盐水组最低，α-MSH组次之，对照组最高(P<0.05)。见表4。大鼠肾、肺组织细胞中KGFR蛋白表达见图1(封三)，可见肾小管上皮细胞、肺泡上皮细胞KGFR蛋白表达呈阳性。

表4 各组大鼠肾、肺组织KGFR平均光密度、实时定量蛋白表达对比

3 讨论

肾脏缺血再灌注损伤易导致急性肾衰竭。虽然随着医疗水平的不断进步，医疗透析技术得到了长足提高，但肾脏缺血再灌注患者的死亡率一直居高不下，主要考虑为肾脏缺血再灌注患者的其他脏器同时会遭到损伤，其中急性肺部损伤最常发生，从而导致IRI患者的死亡率较高[7]。

KGF表达于间质细胞，与KGFR特异性结合，在人体器官稳定性中具有积极作用。人体组织损伤对KGF的表达可产生一定影响，其主要经过蛋白激酶C完成诱导表达，KGF通路还会受到激素、细胞因子和其他因素的影响[8]。如雌激素、糖皮质激素等均可一定程度影响KGF的表达；同时KGF的表达也受到细胞因子影响，如IL-6、IL-8等。KGF与肺、泌尿系统具有联系，是早期肺发育和肺泡II型上皮细胞形态形成的必备调控因子，与肺部晚期上皮细胞分化、表面蛋白合成具有密切联系。在泌尿系统中，后肾间充质、输尿管芽的生长同KGF具有联系， KGF出现缺失易导致肾集合管、肾单位发育较少[9]。研究KGFR在上皮细胞表面的表达对RIR患者肾脏、肺组织的急性损伤治疗有一定意义。

α-MSH是一种神经内分泌激素，在人体脑部、心脏的缺血性损伤中具有保护作用。近年来科研人员将目光投向α-MSH对肾、肺脏的保护研究中，其作用被越来越多的临床研究证实[10-11]。α-MSH具有抗氧化、炎症反应、细胞凋亡等作用，同时刺激保护因子的生成可能也是其在肾肺脏中发挥保护作用的原因。IRI患者会在脂质过氧化作用下形成MDA、氧自由基，其中氧自由基的产生会导致蛋白质、细胞外基质等产生氧化，从而导致组织内微循环遭到破坏，α-MSH抗氧化的机制可能组织氧自由基释放、抑制过氧化作用，降低MDA水平。在一些动物实验中认为，RIR患者的iNOS诱导NO合成能被α-MSH组织影响从而减少硝酸盐组织浓度，抑制组织水肿，组织兴奋性毒性而导致损伤[12-13]。一些研究表明，α-MSH能够调节大鼠IL-6、IL-8及ICAM-1mRNA水平；同时具备一定的抗炎因子活化刺激作用。从抗细胞凋亡上来看，一些学者指出RIR能够促进细胞凋亡，α-MSH能够抑制凋亡机制，起到对上皮细胞的保护作用[14-15]。

本研究中建立产后出血致肾脏缺血再灌注大鼠模型，结果显示对照组大鼠的尿量显著少于其余两组，尿渗透压水平高于其余两组，提示产后出血对肾脏存在一定程度影响。NS组大鼠尿量、Scr、BUN水平高于其余两组，考虑是由于大出血致肾损伤，从而先多尿后少尿，尿量总体增加，肾功能受损水平明显升高。α-MSH组与对照组Scr、BUN水平无差异，提示经α-MSH处理可一定程度保护了肾脏免受大出血影响。在本研究中，各组足月妊娠大鼠肾、肺含水量有一定差异，其中α-MSH组肾、肺脏含水量低于生理盐水组，对照组含水量最低，提示大出血致肾、肺脏组织出现水肿等病理损伤改变，而α-MSH一定程度改善了水肿情况。3组大鼠的肾、肺组织KGF mRNA表达存在差异性，提示KGF mRNA对肾、肺组织的损伤有一定表现。其中对照组大鼠的肾、肺脏KGF mRNA、KGFR平均光密度水平最高，生理盐水组最低，α-MSH干预的大鼠水平居中，可见大出血影响了KGF mRNA、KGFR的表达，但α-MSH有一定的KGF mRNA、KGFR调节功能，两者协同保护肾、肺脏受大出血影响。α-MSH组大鼠的肾、肺脏实时定量水平更趋向于对照组，提示α-MSH对肾、肺脏发挥了一定保护作用。

综上所述，角化细胞生长因子及其受体在足月妊娠大鼠肾、肺脏中有表达，在产后出血致缺血再灌注损伤过程中与肾、肺脏损伤存在关联。α-促黑素能够改变角化细胞生长因子及其受体表达，对大鼠肾、肺脏损伤的病理改变有积极作用，对缺血再灌注损伤有一定保护作用，但损伤程度和临床疗效还有待研究论证。