锌-α2糖蛋白和锌指蛋白32在大鼠睾丸及睾周脂肪中的表达

齐亚楠 崔 彤 马 婧 韩瑞钰 安 琪 谷翊群 王树松*

1.河北省胸科医院(石家庄， 050041)；2.河北师范大学化学与材料科学学院 ；3.河北省计划生育科学技术研究院/国家卫生和计划生育委员会计划生育与优生重点实验室；4.国家卫生健康委科学技术研究所/国家卫生健康委男性生殖健康重点实验室

锌-α2糖蛋白(ZAG)是一种可溶性糖蛋白，被认为是一种新型的脂肪细胞因子，参与机体脂质代谢。精子成熟过程中磷脂成分的改变、精卵结合以及精子细胞膜的流动性均与脂质代谢密切相关。锌指蛋白32(ZBTB32)又称睾丸锌指蛋白，可直接与DNA结合而发挥转录调节作用[1]。目前，有关 ZBTB32的研究多集中在细胞分化及免疫应答等方面。有研究发现，ZBTB32 在睾丸组织尤其是减数分裂前期的粗线期精母细胞中表达最高，推测其可能与精子的发生密切相关[2]。因此，本实验成功构建肥胖大鼠动物模型，通过免疫组织化学方法检测ZAG和ZBTB32在睾丸组织中的定位，蛋白免疫印迹和荧光定量PCR技术检测ZAG和ZBTB32在大鼠睾丸、睾周脂肪中的表达，进一步探索ZAG、ZBTB32与肥胖雄性大鼠生殖的关系。

1 材料与方法

1.1 动物肥胖模型的建立

于河北医科大学动物实验中心购买清洁级雄性SD大鼠20只，体重(103±11)g。适应性喂养1周后，随机分成研究组(高脂饲料喂养)14只和对照组(普通饲料喂养)6只，饲养期间自由进水，12周末时计算大鼠平均体质量。肥胖模型构建成功的标准为大鼠体质量超过对照组平均体质量的20%，最终7只大鼠符合肥胖大鼠模型。

1.2 免疫组织化学染色

取大鼠左侧1/2睾丸组织固定于10%的甲醛溶液中，石蜡切片，脱蜡复水；枸橼酸钠抗原修复；SP-9001 生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒检测ZAG和ZBTB32蛋白表达，其中ZAG、ZBTB 32抗体以1:100比例稀释，DAB显色，苏木素复染、梯度酒精脱水、中性树胶封片，镜下观察ZAG和ZBTB32在两组大鼠睾丸组织表达情况。采用Image-pro plus 6.0软件测定ZAG和ZBTB32表达平均光密度值，分析ZAG、ZBTB32在两组大鼠睾丸中的表达。

1.3 实时荧光定量PCR

采用动物组织总RNA提取试剂盒(ZP404)分别提取睾丸组织及睾周脂肪组织总RNA，按照说明书逆转为cDNA，并以cDNA为模板进行扩增，PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃15 s；63.2℃30 s；72℃30 s；共35个循环。在72℃30 s处收集荧光信号；最后72℃延伸5 min。内参为β-actin，对照组为校准样品，以2-△△CT法计算研究组大鼠睾丸组织及睾周脂肪ZAG和ZBTB32 mRNA的相对表达量。内参、ZAG和ZBTB32引物序列如下。

ZAG引物序列: F5’ TCTATGTGCAGCGAGCCAAG 3’,R 5’ AGTGGGAGGATCTGTTCGGT 3’ZBTB32引物序列: F5’ GGCCTCCATCTCTCCTGGTA 3’, R 5’ CGTTCATCCGGAGAGGGTTC 3’ β actin引物序列: F 5’ ACCCGCGAGTACAACCTTCT 3’,R 5’ GATGCCTCTCTTGCTCTGGG 3’

1.4 蛋白免疫印迹实验

取大鼠睾丸及睾周脂肪于EP管中，向EP管中加500 ml已加入甲基磺酰氟的裂解液，充分剪碎并超声裂解5 min，离心取上清，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。以各组织最低蛋白浓度为参照计算蛋白上样量，100℃煮沸10min；分离胶配制为10%，浓缩胶为5%，80 V恒压30min，待电泳至浓缩胶底部时，将电压转置120V，转膜条件为200 mA，1.5h；5%的脱脂奶粉封闭1.5 h；向膜上滴加稀释的抗体(ZAG和ZBTB32以1:1000稀释，β-actin 1:2000稀释)，4℃孵育过夜；再将标记HPR的羊抗兔二抗(1:8000稀释)室温孵育1.5 h，ECL化学发光试剂盒显影。采用Image J软件测定目的条带和内参条带的灰度值，其中ZAG和ZBTB32蛋白相对表达量用目的条带与内参条带灰度值的比值表示。

1.5 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行分析。采用独立样本t检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1免疫组织化学染色

免疫组织化学染色结果显示，ZAG和ZBTB32在大鼠睾丸生精细胞胞质中表达，见图1(插页)。定量分析结果显示，研究组大鼠睾丸组织中ZAG表达量(25.460±8.350)与对照组(37.670±18.070)相比无差异(P>0.05)，研究组大鼠睾丸组织中ZBTB32表达量(20.510±4.330)与对照组(25.960±7.360)相比无差异(P>0.05)。

2.2 大鼠睾丸和睾周脂肪中ZAG和ZBTB32mRNA相对表达

荧光定量PCR结果显示，研究组较对照组大鼠在睾周脂肪ZAG mRNA的相对表达量(0.048±0.068，1.000±0.000)显著降低(P<0.05)；在大鼠睾丸组织ZAG mRNA相对表达量(0.820±0.760，1.000±0.000)无差异(P>0.05)；研究组和对照组ZBTB32 mRNA相对表达量在大鼠睾丸(0.994±0.770，1.000±0.000)及睾周脂肪组织(0.744±0.650，1.000±0.000)中均无差异(P>0.05)。

2.3 ZAG和ZBTB32在大鼠睾丸组织及睾周脂肪中蛋白表达

蛋白免疫印迹结果显示，研究组大鼠睾周脂肪中ZAG蛋白表达量(0.751±0.030)低于对照组大鼠(1.116±0.021)(P<0.05)；而睾丸组织中ZAG蛋白表达量研究组(0.616±0.025)与对照组(0.605±0.033)无差异(P>0.05)；研究组ZBTB32在大鼠睾丸和睾周脂肪的表达量(1.514±0.057，0.376±0.007)与对照组(1.477±0.035，0.390±0.019)比较无差异(P>0.05)。见图2(插页)。

3 讨论

目前研究认为，肥胖是导致雄性生育力低下的重要原因之一[3]。肥胖对雄性生殖的影响包括精液质量下降、性腺功能减退及勃起功能障碍等，且父代肥胖可导致子代生殖器官发育迟缓，内分泌功能紊乱，使睾丸容积和阴茎长度减小等[4-5]。前期研究发现，肥胖大鼠睾丸组织形态被明显破坏，生精小管内支持细胞和生精细胞减少，出现空泡样改变；精液分析发现，肥胖大鼠精子浓度和精子活力显著降低[6]；肥胖男性精子前向运动百分比显著低于BMI正常男性[7]。可见，肥胖对雄性生育力具有负面影响。

ZAG链至少可结合15个锌离子，且ZAG结合锌离子的多少影响其与游离脂肪酸和β-肾上腺素受体的结合能力[8-9]。ZAG作为重要的脂肪细胞因子可通过上调机体环磷酸腺苷(cAMP)水平、调节脂肪合成中关键酶或以自分泌、旁分泌的形式影响其他脂肪因子的合成而影响脂类代谢[10-11]。前期研究发现，精浆ZAG含量与体质量和腰围呈负相关[7]；Russell 等[12]将纯化的ZAG以不同的剂量分别注射小鼠体内，结果发现，ZAG主要降低小鼠脂肪含量且存在时间依赖性和剂量依赖性；也有研究发现，脂肪组织中ZAG含量与mRNA呈正相关[13]。本研究发现，研究组和对照组大鼠睾丸组织ZAG蛋白和mRNA表达无显著性差异，而睾周脂肪组织中研究组大鼠ZAG蛋白和mRNA表达显著低于对照组大鼠，推测ZAG对肥胖大鼠生殖的调控具有时间性，首先影响睾周脂肪组织，但具体机制需进一步研究。

精浆ZAG含量与雄性生殖密切相关。研究发现，ZAG在大鼠生殖系统各个器官中均有表达且主要表达于附睾尾部，精浆中ZAG主要由附睾尾部上皮细胞分泌[14]，推测ZAG与精子成熟密切相关。研究发现，血清中ZAG水平与精子生成密切相关的激素睾酮呈正相关[15]；重组ZAG抗体可使精子与透明带的结合能力和顶体反应显著降低[16]。研究发现，精浆ZAG含量与精子浓度和精子总数呈负相关[7]。而本研究发现，研究组和对照组大鼠睾丸组织ZAG蛋白表达和ZAG mRNA表达均无差异，推测ZAG对精液质量的影响可能更多的通过精浆微环境而发挥作用。本实验仅研究了睾丸及睾周脂肪组织，可进一步检测精浆ZAG含量和其在附睾及附属性腺中的表达，以更加深入了解ZAG对肥胖雄性生殖的影响。

ZBTB32属于POK蛋白家族，该家族成员N末端有一个BTB/POZ 结构域，主要介导蛋白和蛋白之间的相互作用，C末端含有数个C2H2锌指结构域，可直接与DNA结合而发挥转录调节作用。研究发现，ZBTB32至少存在两种异构体，其中异构体1含有465个氨基酸，在睾丸组织中特异性表达，而异构体2的N-末端缺乏BTB/POZ 结构域，主要在T、B 淋巴细胞中表达，参与机体的免疫应答[1,17-18]。ZBTB32基因敲除小鼠睾丸支持细胞中雄激素受体的表达增加，同时曲细精管细胞凋亡减少[2]。有研究证实，ZBTB32 基因敲除小鼠的精子发生正常且可育，推测该基因可能不是生殖细胞形成过程中的必需基因，在精子发生中仅起到调节作用[2]。本研究发现，ZBTB32 在大鼠睾丸生精细胞胞质中表达，且研究组大鼠睾丸组织和睾周脂肪中ZBTB32蛋白和ZBTB32mRNA 表达与对照组相比无差异，推测ZBTB32基因表达可能与肥胖发生无关。

综上所述，肥胖大鼠睾周脂肪组织ZAG表达显著降低，提示肥胖可能导致ZAG表达异常，影响雄性生殖。