不育男性患者Y染色体AZF区域微缺失及临床表现

杨舒婷 周明连 汤欣欣 毛华芬 张璟璐 许天龙 顾 莹 王雷雷

江苏省连云港市妇幼保健院(222006)

相关统计表明不育中男性因素为30%～50%[1]。多种原因能够导致男性不育，遗传因素成为重要原因， Y染色体微缺失成为继克氏综合征后男性不育的第二大遗传因素[2]。Y染色体微缺失的分子遗传研究也越来越深入[3]。Y染色体长臂l区l带(Yq11)上含有与精子发生有关基因，又称之为无精子因子(AZF)。AZF被定位于Yq11远端，从近到远的3个非重叠区依次为AZFa、AZFb和AZFc[4]。各区域中囊括了若干AZF侯选基因。其中任何区域微小缺失都会诱发生精障碍，导致严重少精子症、无精子症，诱发男性不育[5-6]。AZF不同区域的缺失发生率和缺失的临床表现不尽相同，以AZFc缺失最常见，患者常表现为少精子症。AZF区域的缺失有自然遗传或通过IVF、ICSI垂直传递给下一代男性的风险。所以对需进行辅助生育的男性进行AZF检测非常有意义。本研究收集苏北地区不育及正常生育男性，检测并分析Y染色体微缺失分布及与不育关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2011年6月-2016年8月本院男科门诊确诊的不育症男性920例(观察组)，平均年龄31岁(20～46岁)；100例已育有至少1名子女的正常体检男性为对照组。本研究经本院伦理委员会审批，患者均知情同意。

1.2 检测方法

抽取两组外周血抗凝，采用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit取试剂盒(Cat#:51104) 提取 DNA，-20℃保存备用。对Y染色体AZF区内15个序列标签位点(STS)检测Y染色体微缺失基因(深圳亚能生物技术有限公司生产试剂盒)。STS位点包括AZFa(sY84、sY82、sY86)区，AZFb(sY143、sY124、sY133、sY128、sY134、sY127)区，AZFc(sY254、sY152、sY242、sY239、sY255)区，以及AZFb和AZFc交接区的sY145。以SRY为内参对照，分入4个多重PCR反应体系中进行扩增，分别为I、II、III、IV。各反应扩增体系中的STS位点及目的片段长度见表l。PCR反应体系：14 μl反应液+10 μl水+1μl DNA(20 ng/μl)，总反应体系为25μl。PCR反应条件：50℃孵育10 min，95℃预变性15 min，共35循环(94℃ 30 s、58℃ 60 s、72℃ 60 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物利用2%琼脂糖凝胶电泳45 min(120V)， EB染色，凝胶成像系统观察结果。

表1 各反应体系中STS位点及电泳检测中目的片段长度和位置

1.3 结果判读

若样本阴性对照、空白对照没有出现扩增条带，SRY中内参发现相应条带，在多重PCR中未发现相应条带，则该位点缺失；若检测标本阳性对照、位点出现扩增条带，且阴性对照与空白对照未发现扩增条带，则为无缺失。

2 结果

2.1 临床资料

观察组920例中无精症、少精症、极少精症、弱精症和死精症分别为134例(14.6%)、245例(26.6%)、254例(27.6%)、118例(12.8%)和169例(18.4%)，均为正常男性核型。对照组100例男性均为正常男性核型。

2.2 AZF区域微缺失

观察组检出AZF区域微缺失18例(1.96%)，其中AZFc区微缺失最高为12例(1.30%)，AZFb区微缺失4例(0.43%)，AZFa区微缺失和AZFb和c区均缺失各检出1例(0.11%)。各类缺失中，AZFc区发生率最高为(13例)，其次AZFb区(5例)，AZFa区最低(1例)。共发现6种缺失类型：AZFa区缺失(1例)，AZFb区缺失(1例)，AZFb区sY143部分缺失(2例)，AZF b区sY143、sY134、sY133部分缺失(1例)，AZFb和c区均缺失(1例)，AZFc区缺失(12例)。各类缺失类型的电泳图见图1。各AZF缺失区域中，缺失区域变化最大的为AZFb区，该区域发生频率最高的STS位点为sY143，缺失频率见表2，对照组未发现AZF区域微缺失。

a：正常对照；b：AZFa区缺失；c：AZFc区缺失；d：AZFb和c区均缺失；e：AZFb区缺失；f：AZFb区sY143部分缺失；g：AZFb区 sY143、sY134、sY133部分缺失

表2 AZF区域各区STS位点缺失情况

2.3 AZF区域微缺失临床表现

AZF区域微缺失携带18例中，17例接受进一步临床检测，临床及常规精液检测均精液异常，各类型缺失者精液检查的精子总数、精子浓度、精子活力、精子活率和形态正常率均为0，其中无精症6例，弱精症及少弱精症9例，坏死精子症2例；1例拒绝进一步检查。

3 讨论

Y染色体微缺失被认为是男性不育的重要遗传因素,临床AZF基因区域微缺失相关筛查主要在严重少精症、原发性无精症中辅助生育精子质量筛选与预后判断。随着原发性男性不育症临床诊断率的提升，临床开展AZF基因微缺失检测意义日益凸显。然不同人群中男性Y染色体微缺失发生风险不一，可能有地域与种族差异。国外有报道指出各类男性不育人群AZF基因缺失率在1%～55%[7-9]，本研究为1.96%相对较低，可能与患者人群、种族差异有关。

Y染色体AZF基因区域涵盖了很多与精子生成相关的重要基因，在男性生殖细胞不同发育周期起着不同作用，各位点微缺失将会诱发其功能丧失而导致男性精子发生障碍，临床表现为无精子症、少弱精子症导致男性不育。临床研究表明，AZFa区缺失会对Sertoli细胞、精原干细胞在精曲小管中的生成及分布造成重要影响，且与无精子症的发生有着密切的关系[10]。AZFa缺失较为罕见，临床上表现为唯支持细胞综合征：精液无精子，睾丸组织病理诊断为生精上皮仅为支持细胞，生精细胞不足。AZFb区缺失可对精原干细胞在细胞减数分裂期发展造成影响，主要体现为生精阻滞，主要停留在精子细胞、精母细胞阶段，临床表现为多样化[11]，发生缺失时多伴以其他区域同时缺失，在本研究中发现AZFb区缺失存在多种缺失方式，为各类AZF缺失中区域变化最大的，sY143为发生缺失频率最高的STS位点。已有研究表明SY143的缺失会引起男性精子质量下降，由于目前发现病例数太少，累积数据量不够，尚无明确诊断，故对AZF的微小部分缺失研究仍将继续。AZFc区缺失会影响精原细胞向精子细胞转化，造成精子生成不足。在本研究中，该区域缺失占比最高，是整个AZF缺失区域的热点，另外AZFc区缺失人群的临床表型最多样化，可能与该区域内DAZ基因相关。DAZ基因是一个多拷贝基因家族，在生殖细胞分化的转录失活期具有后转录调控作用，其缺失导致的表现型呈多样化，精子密度可正常，也可出现严重的少精或无精，复合缺失患者表现为少精子症或无精子症[12-14]。AZFb和AZFc交界区由于序列存在交叠，缺失表现两区的缺失表型相似。

本研究结果表明，Y染色体微缺失是不育男性重要原因之一，Y染色体AZF区存在多种类型微缺失，主要以AZFc区缺失为主。检测AZF微缺失从分子水平上明确精液质量病因，从而避免不必要治疗，减少因应用ICSI而带来男性子代临床突变缺失率增加问题。同时本研究还提示，在不育男性的诊断或人工辅助生殖治疗前，筛查Y染色体微缺失应作为常规检查并给予足够重视。