红芸豆植物凝集素凝胶剂杀精与凝集精子效果的实验研究

王静静 姚娅婷 李 阔 郑 永 张 田 王敏康

云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南师范大学生命科学学院（昆明，650500）

以往的研究发现芸豆植物凝集素（KBL）具有凝集精子、抑制受精、抗着床和终止妊娠的作用［1－6］，同时具有良好的抗人类免疫缺陷病毒（HIV）的性能［7－8］，KBL有望成为一种新型的局部使用的杀微生物剂。从润滑和预防的角度看，凝胶剂剂型是最适宜阴道及肛门使用的：一是润滑作用，可有效减少摩擦的阻力和可能对黏膜造成的损伤；二是附着和覆盖作用，即具有一定隔离和保护阴道或直肠黏膜上皮细胞的作用；三是凝集素可以和HIV外壳的GP120蛋白结合，发挥抑制剂的作用。在避孕方面，KBL可通过直接接触精子发挥制动、杀精或凝集精子的作用而达到避孕的目的。但以往的实验是直接使用不同浓度的植物凝集素溶液进行实验研究，而未使用凝集素制剂。本实验研究包含两部分内容：一是观察不同浓度红芸豆植物凝集素（RKBL）的杀精和凝集精子的效果；二是观察含不同浓度RKBL特别是低浓度的凝胶剂在模拟阴道穹隆结构的“V”型玻璃管中对精子穿透的阻碍作用。为凝胶剂配方筛选和药效学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料的制备

1.1.1 RKBL凝胶剂RKBL由本实验室从红芸豆中提取。采用双缩脲法测定其蛋白质含量。主要辅料为0.8%的药用级凝胶剂基质—黄原胶，用其配制成RKBL浓度为5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001mg／ml的凝胶剂。

1.1.2 精液采用人及犬精子进行实验。人精子为健康人手淫法收集，悬浮于无电解质溶液（EF溶液）［9］，4℃保存，1h内使用。犬精子为人工采精，同上述方法保存和使用。

1.2 实验方法

1.2.1 精子凝集实验根据 Sander－Cramer方法［9］，取100μl精液分别与500μl的含有5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001 mg／ml的RKBL溶液混合，迅速吹打均匀后，在20s内各自取出5μl，在显微镜（100×）下观察，5min后再次观察。若5min后100%的活动精子被凝集，为最终结果，否则在此后每20min观察1次，持续观察3h。实验重复15次。

1.2.2 “V”型管穿透试验取外径1.24mm，内径1.00mm，长30mm的玻璃管若干，用酒精灯加热中部至微红，弯曲玻璃管成90°，制成两臂等长的V型管。取用13只V型管，分别在其底部加入10μl RKBL浓度分别为5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025，0.001mg／ml的 RKBL凝胶剂及不含RKBL的0.8%的黄原胶，然后在各V型管的两侧管内加入在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中预平衡1～2h的人输卵管培养液（HTF）各35μl，最后取5μl的精液分别加入到每支V型管一侧的HTF底部。置于CO2培养箱中，15min后取出观察，之后每隔30min取出观察，持续至3h。实验重复8次。

1.3 判定方法

1.3.1 制动、致死不同浓度RKBL使精子致死及凝集情况。

1.3.2 凝集显微镜（100×）下观察精子凝集及其程度。即精子以头对头，尾对尾以及头对尾的混合型彼此粘连在一起，凝集的精子有一定的活动能力，表现为尾部可以摆动，凝块间未凝集的精子能缓慢向前游动。分为四级［10］：一级（＋）为轻度凝集，指每个凝块中＜10条精子；二级（＋＋）为中度凝集，指每个凝块有10～15条精子；三级（＋＋＋）为大片凝集，指每个凝块有≥50条精子；四级为所有精子凝集，即所有精子彼此相互连接。

1.3.3 “V”型管穿透于显微镜下观察精子穿透凝胶剂的情况，从V型管一侧穿越凝胶剂到达V型管另一侧为穿透成功。

2 结果

2.1 杀精和凝集实验

浓度为5，2.5，1mg／ml的RKBL凝胶剂在20s内均能使精子失活，即RKBL浓度≥1mg／ml时，会使精子在20s内失去活动能力，产生制动和致死效应，但不产生凝集现象。而浓度为0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01mg／ml的 RKBL凝胶剂均能使精子产生凝集现象。持续且3h以上直到实验结束时仍然保持凝集状态。见表1。总之，实验结果表明：RKBL浓度为0.025mg／ml时，精子凝集＞50%，但不致死，表现为尾部可以摆动，并能持续3～4h；浓度0.01mg／ml时，精子部分凝集，且凝集不足50%；0.005mg／ml及其以下浓度的RKBL均不能使精子凝集，表现为精子以较快的速度向前运动，但精子的活动分级受一定影响，其向前运动速度不及其在HTF中的运动速度快。

2.2 “V”型管穿透试验

在 V型管中，RKBL浓度为5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025和 0.001mg／ml的RKBL凝胶剂及不含RKBL的0.8%的黄原胶均能阻止精子穿透。当凝胶剂中RKBL浓度≥1mg／ml时，精子不仅不能穿透凝胶剂，而且会在凝胶剂附近完全失去活动能力；当RKBL浓度＜1mg／ml时，精子具有一定的活动能力，表现为能摆动但不能穿透凝胶剂。见图1。

表1 不同浓度RKBL凝胶各时间点精子凝集程度

图1 精子在有RKBL凝胶的“V”型管中的穿透实验

3 讨论

本实验证明：RKBL 浓度 为 5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025 及0.001mg／ml的RKBL凝胶剂不仅能有效阻止精子穿透凝胶剂、改变精子运动状态和促使精子凝集，且RKBL浓度≥1mg／ml的凝胶剂能在20s内制动并杀死全部精子，即体外杀精的最低浓度为1mg／ml。此外，关于精子凝集与受精能力方面，WHO的《人类精液检查与实验室处理》（第五版）指出，当50%或更多的活动精子被粘附时，精子宫颈黏液穿透能力和体外受精率受影响，该手册以50%活动精子被粘附（凝集）作为阈值，即当有50%或更多的活动精子被粘附时即可诊断为免疫性不育［10］。笔者认为，RKBL处理精子后的凝集情况与此类似，因此凝集精子的比例也可以作为受精率的判断标准。本实验结果显示，即使 RKBL的浓度降至0.025mg／ml时，精子凝集仍超过50%。这样使得RKBL凝胶剂有较高的避孕有效系数。狭义的杀精子剂应该包括用Sander－Cramer方法试验可有效杀灭精子的制剂，除此之外，还应该包括可促进精子凝集而使之失去受精作用的制剂，即广义的杀精子剂。另外，本实验结果表明，配制RKBL凝胶剂的凝胶剂基质本身也可阻止精子穿透，因此可与RKBL形成良好的协同作用。也就是高浓度的RKBL凝胶液具有杀精作用，中低浓度具有凝集精子的作用，以及凝胶基质本身具有物理屏障、缓释和覆盖作用。

外用杀精剂是在阴道局部发挥其杀精作用的非激素类避孕药物，使用方便，对机体的干扰较小，为人们所乐于接受［11］。多年来，国内外使用最多的外用避孕药为壬苯醇醚（N－9），是目前使用最普遍的一种外用杀精子药［12］。人们曾寄希望N－9用于预防性传播疾病包括预防HIV的传播。但2001年，相关研究已明确，N－9非但不能预防HIV经阴道传播，反而增加了 HIV的感染率［1－2］。2007年12月，美国FDA要求生产商在说明书上添加警告，指明该产品无法预防性传播疾病（包括艾滋病），并且有可能增加感染艾滋病的危险［13］。联合国艾滋病规划署（UNAIDS）和WHO提出，迫切需要研发新的多功能预防技术来保护女性生殖健康。研制兼具避孕和预防AIDS／STDs双功能的外用避孕药物已成为发展趋势和研究热点［14］。在性传播已成为HIV感染和传播的主要途径的今天，研究用于预防包括HIV感染和性传播疾病的阴道和直肠用杀微生物剂具有迫切的需要。相关的研究结果也不断证明KBL在防治HIV及其它病毒性疾病方面的有效性［15－17］。

前期研究证明长期使用2.5mg／ml浓度的RKBL凝胶剂对小鼠阴道上皮细胞无刺激，不会引起阴道细胞破损等不良反应［18］。涂喜庆等［19］实验证明5mg／ml浓度的RKBL制剂对妇女阴道无刺激，不会产生任何不适感。本研究结果看，RKBL凝胶剂中的RKBL浓度在0.025mg／ml时，精子凝集超过50%，也就是说，RKBL凝胶剂在稀释200倍时仍然可以起到有效的避孕作用。众所周知，在实际使用中，凝胶剂进入人体后，由于性行为和体液稀释等因素，浓度可能会发生很大的变化，而RKBL凝胶剂在稀释200倍时仍然有效，表明RKBL凝胶剂具有很高的安全系数和避孕的可靠性。同时，RKBL还可以促进女性阴道内的乳酸杆菌增值，从而恢复和保持女性正常阴道菌群生态。乳酸菌可以防止病原体的入侵，包括导致性传播疾病的艾滋病毒在内［20］。RKBL的浓度为1mg／ml时，能明显促进乳酸杆菌的生长，并且在一定范围内呈现剂量效应依赖性的关系［21］。虽然精子凝集不能完全被证明为不孕的免疫性原因，但是精子凝集能够影响精子的活力程度，而精子活力程度与妊娠有着密切关系［10］。所以含RKBL的凝胶剂作为一种杀精子剂是可行的，具有较好应用前景。

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