精浆生物大分子氧化损伤与精液参数的相关性研究

倪文丽 王宝俊 田 甜 张 继 马 乐 王琳琳＊ 任爱国

1.北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京大学生育健康研究所，卫生部生育健康重点实验室（100191）；

2.首都医科大学附属北京妇产医院

已婚夫妇中不孕不育症患病率约为15%［1］。在不孕不育症病因中，至少50%与男性因素有关［2］。男性不育的病因和机制十分复杂，个体差异较大，临床上绝大多数男性不育的病因尚不清楚。长期以来，精液常规分析是评价男性生育力的主要指标。有研究发现，氧化损伤造成的精子结构和功能的改变可对精子质量产生影响［3］。以往研究多探讨精子DNA氧化损伤与精液参数关联性，提示DNA氧化损伤可降低精液质量［4－6］，但目前国内尚未见蛋白质氧化损伤、脂质氧化损伤与精液参数的相关性研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象来自于2014年12月－2015年8月期间因不育就诊北京妇产医院的男性。研究对象纳入标准：夫妇婚后同居1年以上未用避孕措施而未能使妻子受孕或生育，年龄21～49岁的成年男性。排除标准：①性功能障碍（如勃起功能障碍、射精功能障碍）；②有泌尿生殖系统疾病史（双侧隐睾、输精管切除）；③现有急性泌尿生殖系统感染；④有生育能力异常家族遗传病；⑤曾经或正在接受激素治疗；⑥已明确诊断不孕不育原因为女方因素所致。筛查119例，由于部分样本采集不全，共纳入96名研究对象。由经过培训的调查员采用结构式调查表，对研究对象进行面对面询问调查。问卷调查信息包括年龄、文化程度、身高、体重、吸烟情况、饮酒情况等。本研究已经通过首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会批准，研究对象已全部签署知情同意书。

1.2 精液样本的采集

受试者按照要求禁欲2～7d后，在医院通过手淫法留取全部精液。采集后的精液样本置于37℃水浴箱中，观察其液化情况，待精液液化后，记录液化时间，充分混匀后随即对精液进行常规分析。将剩余精液进行4℃3000g离心15min后，取上清（精浆），－20℃冷冻保存。

1.3 精液常规分析

严格执行WHO《人类精液和精子－宫颈黏液相互作用实验室检验手册》（第五版）操作要求，采用计算机辅助精子分析系统（北京伟力公司WLJY9000）进行精液常规分析。各指标正常参考范围为：精子浓度≥15×106／ml，前向运动精子率≥32%，畸形精子率＜4%。分别根据各精液指标是否在正常范围内，将研究对象分为正常组和异常组，再对氧化损伤指标进行分析。

1.4 蛋白质及脂质氧化损伤指标的检测

蛋白质氧化损伤程度以羰基衍生物（PC）水平表示，脂质氧化损伤程度以8－异前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）水平表示。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测精浆中 PC水平、8－iso－PGF2α水平。ELISA试剂盒来自于Cell Biolabs公司，试剂盒货号分别为STA－310、STA－337。所有检测方法均严格按试剂盒说明进行操作。

1.5 统计学分析

统计学分析使用SPSS 20.0软件，计量资料经正态性检验，符合正态分布，以均数±标准差表示。使用t检验进行各组PC水平、8－iso－PGF2α水平比较。计数资料以%表示，使用χ2检验或Fisher检验进行各组一般人口学特征比较。使用Pearson检验分析PC、8－iso－PGF2α与各精液参数的相关性。使用多重线性回归控制年龄、文化程度、BMI、吸烟、饮酒等混杂因素后，分析8－iso－PGF2α对精子浓度影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般特征

96名研究对象年龄为（31.2±5.1）岁，体质量指数（BMI）为（26.4±5.0）kg／m2。各精液指标正常组和异常组的人口学特征无统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.2 各组蛋白质和脂质氧化损伤指标比较

异常组8－iso－PGF2α水平高于正常组（P＜0.05），其它各指标比较两组无差异（P＞0.05）。见表2。

表1 各精液指标正常组和异常组人口学特征比较［例（%）］

表2 两组氧化损伤指标检测比较（珚x±s）

2.3 蛋白质、脂质氧化指标与精液参数相关性分析

使用Pearson相关分析，在控制了年龄、BMI、文化程度、吸烟、饮酒等因素后，8－iso－PGF2α水平与精子浓度负相关（r＝－0.254，P＝0.018），与前向运动精子率及畸形精子率无统计学相关；PC水平与各精液参数无统计学相关性。见表3。

2.4 8－iso－PGF2α水平和精子浓度多重线性回归分析

对以上相关分析中P＜0.05的变量进一步行多重线性回归分析。以精子浓度为因变量，以8－iso－PGF2α水平、年龄、文化程度、BMI、吸烟及饮酒为自变量，进行多重线性回归分析。变量筛选方法为Enter法。在调整了年龄、BMI、文化程度、吸烟、饮酒后结果显示，8－iso－PGF2α水平每增加1ng／ml，精子浓度平均减少7×104个／ml（P＜0.05）。

表3 精液参数与氧化损伤指标相关性分析

3 讨论

本研究在96例研究对象中探讨了蛋白质氧化损伤、脂质氧化损伤与精液参数的相关性，发现精子浓度的降低可能与脂质氧化损伤有关。提示对少精子症及无精子症患者进行脂质氧化损伤检测可能有助于发现其致病原因。

本研究发现8－iso－PGF2α在精子浓度异常组的水平高于正常组，随着8－iso－PGF2α水平的增加，精子浓度降低，结果与以往文献报道类似，Khosrow－beygi等［7］在来自伊朗的46例精液参数异常者和16例健康者中，发现精液参数异常者8－iso－PGF2α水平高于健康者，8－iso－PGF2α水平与精子浓度、总运动精子率负相关。本研究与上述研究结果类似，相关系数都不高，可能由于样本量少或一些混杂因素的影响。本研究在96例研究对象中未发现8－iso－PGF2α与前向运动精子率及畸形精子率有相关性，文献检索未发现此类研究报道，而多以丙二醛作为脂质氧化损伤指标的研究，如Singh等［8］研究来自印度的48例精液参数正常不育者和100例精液参数异常不育者中，发现精液参数异常组丙二醛水平高于正常组，精浆中丙二醛水平与精子浓度、前向运动精子率、精子正常形态率呈负相关。Ni等［9］研究来自中国的88例精索静脉曲张不育者和25例健康者中，发现丙二醛与精子浓度、总运动精子率、前向运动精子率负相关，但与畸形精子率无相关性。8－iso－PGF2α是脂质过氧化反应的特异性产物，不受饮食中脂质含量影响，具有很强的生物学活性，目前被认为是反映脂质过氧化损伤的最好指标［10］。

本研究未发现蛋白质氧化损伤与精子浓度、前向运动精子率、畸形精子率的相关性。目前尚未发现文献中相关报道。后续研究中需扩大样本量进一步验证蛋白质氧化损伤与精液参数的相关性。

PC、8－iso－PGF2α目前是评价蛋白质氧化损伤、脂质氧化损伤使用最多的指标［10－11］。氧化应激诱导蛋白质硫醇基过氧化，会使精子的功能和结构发生改变，使精子更容易受到损伤。蛋白质氧化损伤还影响蛋白的磷酸化、糖基化及ATP的生成，从而关联到精子的授精能力［3，12］。精子膜中含有大量的不饱和脂肪酸，极易发生脂质氧化损伤，造成精子膜的流动性、通透性和液态性发生改变，引起精子的完整性、运动性和功能等发生不可逆的损伤［3，12］，进而可能导致精子浓度的降低。

现阶段评估男性生育能力的手段主要是传统的精液常规分析。但常规精液参数分析只是从形态和数量方面进行分析，而对精子功能和受精能力方面提供的信息有限，不能对男性不育的原因提供精确的诊断［4］。Agarwal等［13］研究建议对于不明原因的不育症患者可进行活性氧的检测，对男性生育力进行一定程度的评价。本研究发现8－iso－PGF2α在精子浓度异常组的水平高于正常组，提示对于少精子症及无精子症患者，进行脂质氧化损伤检测可能有助于发现其致病因素，为临床诊断和开展新的治疗策略提供帮助。

本研究初步探讨了脂质氧化损伤、蛋白质氧化损伤与精液参数的关系，提示脂质氧化损伤可能与精子浓度降低有关。后续研究应扩大样本量，进一步验证生物大分子氧化损伤对男性生育力的影响，并进行机制的深入探讨。

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