益母草碱对小鼠生理性月经样模型崩解期的作用

陈西华 贺 斌 王尚明 王 宁 张 斌 张树成 徐祥波

国家卫生计生委科学技术研究所 (北京，100081)

·基础研究·

益母草碱对小鼠生理性月经样模型崩解期的作用

陈西华 贺 斌 王尚明 王 宁 张 斌 张树成 徐祥波*

国家卫生计生委科学技术研究所 (北京，100081)

目的：研究益母草碱对小鼠生理性月经样模型的作用。方法：建立小鼠生理性月经样模型，将人工蜕膜化的假孕小鼠双侧卵巢切除，引发孕酮(P4)撤退，随后蜕膜化子宫内膜发生崩解坏死，模型小鼠出现月经样出血。在P4撤退前至撤退后24h，给予模型小鼠益母草碱，观察P4撤退后小鼠阴道出血状态，子宫大体形态以及组织形态学变化。结果：模型小鼠均在P4撤退后12～24h观察到阴道出血。与空白对照组相比，P4撤退后24h益母草碱药物处理组小鼠子宫颜色较深，子宫充血较显著。小鼠子宫腔上皮下的血管显著扩张，特别是腔上皮下血管扩张与红细胞渗出严重，且范围较对照组更广。通过统计学分析证实，益母草碱组充血面积高于对照组(P=0.011)。结论：提示益母草碱可导致小鼠子宫内血管扩张与红细胞渗出，其中的药理作用和分子机制有待进一步研究。

活血化瘀；益母草碱；出血；孕酮撤退；月经样模型

益母草常用于治疗药物流产后子宫异常出血和月经不调，疗效确切，效果显著[1]。中医认为益母草具有活血祛瘀，调经消水之功效。益母草的药理作用和它所含生物碱密切相关，如益母草碱、水苏碱、益母草啶和益母草宁等。其中，益母草碱是益母草特有的生物碱，近年来受到研究者的广泛关注，但其药理作用与分子机制及在月经中的作用尚不清楚。本研究建立的小鼠月经样模型是月经研究的良好平台[2-3]，本研究利用其模型初步探索益母草碱对月经的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与实验材料

SPFII级成年(13w)NIH小鼠，雄鼠与雌鼠各10只(国家卫生计生委科学技术研究所实验动物中心提供)。小鼠在可控的条件下给予充足的水和食物饲养(光照6:00 ～ 18:00、温度21±1℃)。所有实验程序均获得国家卫生计生委科学技术研究所动物伦理委员会审查批准。益母草碱(陕西森弗高科实业有限公司)，花生油(鲁花)，常规石蜡切片HE染色试剂等。

1.2 小鼠月经样模型的建立[3]

将雌鼠与结扎输精管的雄鼠进行交配，次日中午12:00见栓记为0.5d，获得假孕雌鼠。48h后(2.5d)，小鼠子宫宫腔内注射15μl花生油诱导子宫内膜发生蜕膜化。蜕膜化诱导48h后(4.5d)，将小鼠双侧卵巢切除，引发孕酮(P4)撤退，此时计为P4撤退0h；在接下来的48h内，小鼠子宫内膜发生崩解出血，从宫腔脱落并由阴道排出；随后，子宫内膜逐渐修复，直至48h子宫腔上皮被覆完全。在P4撤退的0～24h子宫内膜蜕膜化细胞逐渐坏死，至24h崩解程度最高，定义为崩解期。

1.3 分组与处理

将月经样模型小鼠分为益母草碱药物处理组(益母草碱组)与空白对照组(对照组)。每个益母草碱组与对照组小鼠数量均不少于5只。益母草碱组小鼠从P4撤退前48h 12:00开始，间隔6h，分12次进行腹腔注射给药(给药剂量30mg/kg/次)。对照组小鼠以同样的方式腹腔注射等体积生理盐水。益母草碱组与对照组小鼠均在P4撤退后12h、16h与24h，进行阴道细胞学涂片观察阴道出血，P4撤退后24h处死取材。未发生显著出血的模型小鼠为诱导蜕膜化失败被剔除。

1.4 小鼠子宫观察与统计学分析

小鼠子宫取材后用4%多聚甲醛制固定24h后，制成常规石蜡切片，进行常规HE染色和组织观察形态学观察。利用图像处理软件，分别统计小鼠子宫横切切片中蜕膜化组织面积，充血区域的面积，计算充血区域在蜕膜化组织中所占比例。将对照组与益母草碱组中每个样本的相对充血面积进行统计学分析，计算标准差并进行t检验。

2 结果

2.1 两组小鼠子宫形态及组织形态学观察

益母草碱组与对照组小鼠均在12～24h观察到出血，16h与24h出血量最大。在P4撤退后24h，对照组小鼠子宫大体形态较粗呈暗红色(图1 A)。小鼠子宫组织切片HE染色观察，子宫内膜蜕膜化区域细胞大部分为陈旧性坏死，绝大多数细胞核固缩，细胞质完全溶解，无法辨别细胞界线，红细胞渗出，坏死的子宫内膜与宫腔有明显的分离带。蜕膜化的子宫内膜脱落后，基底层无上皮被覆，呈裸露状态(图1 D，G)。小鼠月经样模型给予益母草碱后，其子宫大体呈暗红色，较对照组颜色更深，且充血明显(图1 B，C)，其核固缩、细胞凋亡等崩解表型与对照组相似(图1 E，F)。但与对照组相比，益母草碱组子宫内膜中血管扩张与红细胞渗出程度明显增强，特别是子宫腔上皮下的血管扩张显著，且扩张的血管中可见大量的红细胞(图1 H，I)。对照组5只小鼠中仅有1只呈现血管扩张现象，而益母草碱组5只小鼠均有显著的血管扩张现象。

2.2 益母草碱对子宫内膜充血程度的影响

相对充血面积见图2A。对照组相对充血面积为5.08±3.78%，其中多数<5%，仅一只小鼠样本>10%；益母草碱组为13.97±4.70%，绝大多数相对充血面积>10%，最高达到20%(图2B)。将以上数据进行t检验，益母草碱组小鼠子宫充血程度高于对照组(P=0.011)。

3 讨论

月经不调是妇科常见病，严重影响和制约女性工作和生活。目前西医主要以雌、孕激素调整月经周期及促排卵的方法治疗月经不调[4]。而中医治疗月经不调的历史由来已久，且副作用小。益母草是中医临床治疗中用于活血化瘀的常用药，可治疗月经不调、产后瘀痛。生物碱被认为是益母草的有效成分[5]。本研究对益母草碱在月经发生中的作用进行了初步探索。

A：对照组子宫大体 D：组织形态低倍图 G：子宫局部放大高倍图 B、C：益母草碱组子宫大体 E、F：组织形态低倍图 H、I：局部放大高倍图 (D，E，F图中方框区域的放大图分别为G，H，I)

图1 对照组与益母草碱组子宫大体形态与组织形态学观察

A：相对充血面积 B：益母草碱组相对充血面积显著高于对照组(*P= 0.011)

图2 对照组与益母草碱组相对充血面积计算与统计学分析

现代医学研究显示，益母草制剂能够治疗药物流产后出血与月经恢复，疗效显著。口服益母草胶囊能够缩短人工流产术后患者月经恢复时间，缩短阴道持续出血时间，且未发现不良反应[6-8]，益母草碱施予药物流产后出血患者也具有良好的预后效果[9]。益母草碱治疗流产后症状的作用机制在动物研究中得到阐释。李霞等[10]利用大鼠药物流产模型给予益母草碱发现，益母草碱能减少子宫出血量，缩短出血时间，明显减少宫内滞留物，增强子宫收缩活动。此外，在原发性痛经临床治疗中，益母草颗粒治疗组治疗效率显著高于对照组[11]。研究显示[12]，益母草碱能提高血清中雌二醇水平，还可通过提高大鼠下丘脑促性腺激素释放激素的表达，促进黄体生成素和卵泡激素分泌，从而上调子宫中雌二醇受体mRNA的表达，进一步加强对子宫内膜的修复。以上结果说明，益母草碱可从多个方面显著促进人工流产后子宫内膜的修复与再生。

本研究利用小鼠月经样模型探索益母草碱在月经发生中对子宫内膜的作用。结果显示，在小鼠月经样模型崩解期给予益母草碱后，子宫内膜腔上皮下扩张的血管的数量与扩张程度增加，并有大量红细胞渗出。由此提示，益母草碱可能通过改变血管内皮细胞的通透性，引起血管扩张与红细胞弥散。该现象在此前的流产动物模型研究中未观察到。益母草碱在月经发生中的药理作用和分子机制还有待进一步研究。

[1] Wojtyniak K, Szymanski M, Matlawska I. Leonurus cardiaca L. (motherwort): a review of its phytochemistry and pharmacology[J]. Phytother Res, 2013, 27(8): 1115-1120.

[2] Xu X B, He B, Wang J D. Menstrual-like changes in mice are provoked through the pharmacologic withdrawal of progesterone using mifepristone following induction of decidualization.[J]. Hum Reprod, 2007, 22(12): 3184-3191.

[3] 曹惠子，徐祥波，陈西华等. 利用假孕小鼠建立小鼠行经模型的研究[J]. 生殖医学杂志, 2010, 19(1): 35-39.

[4] 齐瑞文. 中医治疗妇科月经不调的临床探析[J]. 中国社区医师, 2015(14): 91-92.

[5] 贺春晖，赵懿清，李霞等. 益母草碱药理作用的分子机制研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2013(12): 1419-1423.

[6] 陈辰，胡小荣. 鲜益母草胶囊用于人工流产术后疗效观察[J]. 北方药学, 2014(01): 28-29.

[7] 王倩倩，杜炜杰. 鲜益母草胶囊对人工流产术后临床效果分析及月经恢复情况观察[J]. 中华中医药学刊, 2015(01): 249-251.

[8] 王晓茹. 益母草胶囊用于药物流产后的临床疗效观察[J]. 吉林医学, 2014(31): 6979-6980.

[9] 黄霞. 研究分析药物流产后出血患者实施益母草碱的预后效果[J]. 中国卫生产业, 2014(24): 187-188.

[10] 李霞，陈飞虎，袁凤来等. 益母草碱对药物流产后大鼠子宫的作用研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2009(05): 481-486.

[11] 王利分. 益母草颗粒治疗原发性痛经的临床效果分析[J]. 中国农村卫生事业管理, 2014(09): 1133-1135.

[12] 赵懿清，李霞. 基于下丘脑-垂体-卵巢轴研究盐酸益母草碱对药物流产后子宫异常出血作用机制的实验研究[J]. 苏州大学学报(医学版), 2011(04): 564-568.

[责任编辑：董 琳]

The effect of Leonurine on endometrium break down in physiological menstrual like model mouse

CHEN Xihua, HE Bin, WANG Shangming, WANG Ning, ZHANG Bin, ZHANG Shucheng, XU Xiangbo*

NationalResearchInstituteforFamilyPlanning,Beijing,10081

*Correspondingauthor:xiangboxuhappy@126.com

Objective: To study the effect of Leonurine hydrochloride (Yimucao) on physiological menstrual like model mouse. Methods: The menstrual like model mouse was established as follow, the artificially decidualized pseudopregnant female mice were

bilateral ovariectomy to trigger progesterone (P4) withdrawal, which resulted in endometrium breakdown, and the model mice appeared physiology menstruation. Leonurine was administrated to the model mouse from P4 withdrawal before to 24 hours after, so that the changes of mouse vaginal bleeding, general morphology and histomorphometry were observed. Results: Vaginal bleeding was observed in all mouse models from 12 to 24h after P4 withdrawal. At 24 hours, in Leonurine group, the uteri of mice were darker, and hyperemias of uteri were heavier than those in control group. Vasodilation in the endometrium breakdown area of the uterus was observed after Leonurine delivery, especially the area surrounding the luminal epithelium, which extended much wider compared to mice in control group. Statistical analysis further confirmed the relative hyperemia area was significantly higher in Leonurine group(P= 0.011). Conclusion: Leonurine hydrochloride is able to increase endometrial vasodilation and erythrocyte diapedesis in physiological menstrual like model mouse, however its pharmacological effect and functional mechanism need to be further explored.

Circulation promoting and stasis removing; Leonurine; Bleeding; Progesterone withdrawal; Menstrual like model mouse

2015-11-20

2016-05-12

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.07

*通讯作者：xiangboxuhappy@126.com