磁性纳米吸附剂对GST-tagged蛋白的分离纯化

邹雪艳,孙 新,秦明明,董 烁，张于涛,曹朋乐,李强伟,柴 云*

(1.河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004； 2.河南大学 化学化工学院，河南 开封 475004)

磁性纳米吸附剂对GST-tagged蛋白的分离纯化

邹雪艳1,孙 新2,秦明明1,董 烁1，张于涛1,曹朋乐1,李强伟2,柴 云2*

(1.河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004； 2.河南大学 化学化工学院，河南 开封 475004)

本文以Fe3O4/半胱氨酸(以Fe3O4/Cys)为载体，通过在其表面修饰功能化的谷胱甘肽(GSH)基团，得到Fe3O4/Cys-GSH纳米吸附剂，可直接应用于谷胱甘肽S-转移酶标记(GST-tagged)融合蛋白的亲和分离. 实验结果表明，制备的Fe3O4/Cys-GSH纳米吸附剂对GST-tagged融合蛋白具有特异性、普适性、重复利用性能，可实现对目标蛋白的快速、高效分离，具有潜在的市场应用价值.

四氧化三铁；L-半胱氨酸；亲和分离；谷胱甘肽S-转移酶标记(GST-tagged)

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一组具有多种生理功能的蛋白质，在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击中起到重要作用，是体内代谢反应中II相代谢反应的重要转移酶[1]. 同时GST还是一种新的肿瘤标志物，对肝癌、肺癌、卵巢癌腺癌、腺鳞癌等具有一定的预测作用[2-4]，为临床治疗及预后判断提供理论依据. 因此分离、纯化GST及GST标签(GST-tagged)蛋白具有十分重要的意义.

目前常见的蛋白质提纯方法有：亲和沉淀法、电泳法、透析法、层析法、超速离心法等[5-10]. 其中亲和沉淀法因其具有操作简便、易于放大等优点，被认为是蛋白质纯化强有力的技术手段. 早在1997年河北医科大学刘满英等[11]综述了以壳聚糖为载体，通过表面不同功能化后，实现对牛血清蛋白、酶蛋白的分离、纯化. LEE等[12]以聚醛树脂为载体，通过在表面修饰Ni-NTA基团，从而实对His-tagged蛋白的亲和分离. 重庆医科大学游莉等[13]，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对融合蛋白GST-hS100A9进行了诱导重组菌表达，最后经过谷胱甘肽-琼脂糖4B(GS4BB)对其进行分离纯化. 华南理工大学罗立新教授[14]利用 GSTrapFF 1 mL和BIO-RADLP 层析系统亲和层析柱对GST-SrtAΔN59蛋白进行了分离纯化. 为了实现对目标蛋白的快速、高效分离，选用磁性材料为亲和吸附剂载体，显得尤为重要. 磁性四氧化三铁是一种常用的磁性材料，它制备工艺简单、成本低廉、磁响应性强，在肿瘤治疗、细胞分离、催化、医药等领域均有广泛应用[15-16]. 本文报道了一步法合成Fe3O4/Cys磁性微球，通过表面生物功能化后直接用于GST-tagged蛋白的亲和分离.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

三氯化铁(FeCl3·6H2O，≥99.0%)、无水乙酸钠(CH3COONa，≥99.0%)、L-半胱氨酸(L-Cys，≥99.0%)、谷胱甘肽(GSH，≥99.0%)、氯化钠(NaCl，≥99.0%)、氯化钾(KCl，≥99.0%)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司，乙二醇((CH2OH)2，≥99.0%)购自天津市富宇化学式剂有限公司，无水乙醇购自安徽安特食品股份有限公司，0.01 mol pH=7.4 PBS(KCl 2.08g、NaCl 8.03 g、KH2PO40.25 g、Na2HPO4·12H2O 2.31 g)磷酸缓冲溶液，KH2PO4购自天津市基准化学试剂有限公司，十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺、Na2HPO4·12H2O来自国药集团化学试剂有限公司. 试剂均为市售分析纯.

1.1.2 仪器

扫描电子显微镜(SEM，JSM-5600，日本)，傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR， Nicolet 6700，美国)，热重分析仪(TG，TGA/DSC1，瑞士)，X射线粉末衍射仪(XRD，X’Pert Philips，荷兰)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，Power PAC 300，中国)，电热鼓风干燥箱(101F-1，中国)，电子天平(BS224S，中国).

1.2 实验步骤

1.2.1 Fe3O4/Cys-GSH的制备[17]

称取1.0 g FeCl3·6H2O，2.7 g NaAc，0.1 gL-Cys溶于30 mL乙二醇中，室温搅拌30 min后，转入高压反应釜，于200 ℃反应8 h. 自然冷却至室温，用无水乙醇和蒸馏水各洗三次，60 ℃干燥24 h即得Fe3O4/Cys样.

称取 3 mg Fe3O4/Cys样品于10 mL离心管中，超声5 min，用0.01 mol ·L-1pH=7.4的PBS洗涤两次，加入10 mL 8 mg ·mol-1GSH，超声10 min后放入恒温摇床37 ℃反应24 h(120 r·min-1). 产物用0.01 mol·L-1pH=7.4的PBS洗涤6次，沉淀分散于25%的乙醇溶液中于4 ℃下保存.

1.2.2 GST-tagged融合蛋白的分离、纯化

取60 μL浓度为30%(质量分数)的Fe3O4/Cys-GSH用0.01 mol·L-1pH=7.4的PBS溶液洗涤3次，随后加入1 000 μL GST-tagged细胞裂解液，于4 ℃孵育2 h. 离心后，沉淀用1 000 μL PBS洗涤3次，加入30 μL 50 mmol·L-1的GSH进行洗脱，离心后上清即为目标蛋白.

2 结果与讨论

2.1 磁性微球的表征

图1为制备的Fe3O4/Cys(a)和Fe3O4/Cys-GSH(b)样品SEM图. 从图1中可以看出，制备的样品为球形颗粒形貌，粒径均一，平均粒径为30～40 nm，分散均匀.

图1 制备Fe3O4/Cys(a)和Fe3O4/Cys-GSH(b)的SEM图Fig.1 SEM images of Fe3O4/Cys (a) and Fe3O4/Cys-GSH (b)

图2为制备Fe3O4/Cys(曲线1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲线2)样品的XRD图，从图中可以看出，两条曲线在2θ=30.3°，36.5°，42.8°，53.1°，56.8°和62.5°处具有明显的衍射峰，对应于立方相Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)以及(440)晶面(JCPDS编号19-629)，说明表面功能化后并不影响样品的主体结构.

图2 Fe3O4/Cys(曲线1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲线2)的XRD图Fig.2 XRD patterns of Fe3O4/Cys (curve 1) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 2)

图3为制备Fe3O4/Cys(曲线1)、Fe3O4/Cys-GSH(曲线2)样品的TG图，从图中可以看出两个样品从室温20～740 ℃均有明显的失重：其中室温-240 ℃失重率分别为5.9%(曲线1)、6.3%(曲线2)，归因于样品表面吸附水或结合水失水. 在240～580 ℃区间的失重是由于表面修饰基团的热分解，失重率分别为6.0%、7.2%，Fe3O4/Cys-GSH的失重率比Fe3O4/Cys增加了1.2%，为表面修饰-GSH基团的失重，间接说明GSH成功的修饰在Fe3O4/Cys-GSH上面.

图3 Fe3O4/Cys(曲线2)和Fe3O4/Cys-GSH(曲线1)样品的热重图Fig.3 TG curres of Fe3O4/Cys (curve 2) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 1)

图4 Fe3O4/Cys(曲线1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲线2)样品的红外图Fig.4 IR spectra of Fe3O4/Cys (curve 1) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 2)

图4为制备Fe3O4/Cys(曲线1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲线2)的红外光谱图. 从图中可以看出，两条曲线在584 cm-1处均出现了明显的吸收峰，属于Fe3O4中Fe-O键的特征吸收峰[18]. 3 460 cm-1处对应Fe3O4/Cys中-NH2和-OH的伸缩振动峰[19]. 与曲线1相比，曲线2多了2 930 cm-1及2 880 cm-1两个峰，归属于GSH中-CH3及-CH2-的伸缩振动峰. 另外在1 730 cm-1处出现了酰胺I带的特征吸收峰，来自于表面修饰-GSH中的酰胺键[20].

2.2 分离目标蛋白

2.2.1 Fe3O4/Cys-GSH样品的制备及其分离目标蛋白的示意图

蛋白质常常以复杂混合物的形式存在于生物体的细胞或者组织中. 亲和沉淀法是一种分离蛋白质、酶的常用表征方法，其基本原理是利用蛋白质和一种特定的配体分子特异性结合，从而达到从混合蛋白中提纯目标蛋白的目的. 图5为Fe3O4/Cys-GSH样品的合成及其对GST-tagged蛋白分离、纯化过程. 由图所示，样品从制备到分离目标蛋白共需三步：首先，以FeCl3·6H2O为铁源，采用溶剂热法一步合成了复合纳米材料Fe3O4/Cys；随后，在该复合微球表面修饰-GSH基团，形成Fe3O4/Cys-GSH磁性纳米亲和吸附剂，最后，制备的磁性吸附剂直接从混合蛋白中分离纯化GST-tagged融合蛋白.

图5 Fe3O4/Cys-SH样品的制备及分离GST-tagged 蛋白示意图Fig.5 Schematic representation of the preparation procedure of Fe3O4/Cys-SH and its enrichment and separation of GST-tagged proteins

2.2.2 SDS-PAGE分析

图6为Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂分离GST-tagged LOV蛋白的SDS-PAGE图，泳道1为Marker，泳道2为混合蛋白，泳道3-5分别为磁性吸附剂第一、二、三次分离目标蛋白. 从泳道1可以看出制备的Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂具有很好的特异性，能快速从混合蛋白中分离、纯化GST-tagged蛋白. 为了考察该吸附剂的重复利用性能，我们对分离过GST-tagged LOV蛋白的Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂用PBS洗涤后，继续加入混合蛋白，实验过程与第一次分离过程相同. 从泳道4，泳道5可以看出，该吸附剂均具有较高的特异性，说明制备的磁性吸附剂具有很多的重复利用性能.

图6 Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂重复利用的SDS-PAGE图：泳道1，Maker；泳道2，混合蛋白；泳道3，第一次分离；泳道4，第二次分离；泳道5，第三次分离Fig.6 SDS-PAGE analysis of proteins by reused Fe3O4/Cys-GSH magnetic adsorbent. Lane1, Marker; Lane 2, GST tagged LOV E. coil lysate; Lane 3-5, the fractionsreleased from reused Fe3O4/Cys-GSH NSs up to three times: Lane 3, 1 st; Lane 4, 2 nd; Lane 5, 3 rd

为了验证制备微球对GST-tagged融合蛋白的普适性，我们采用GST-tagged LOV、GST-tagged N2、GST-tagged GPX3三种融合蛋白作为实验对象. 图7为Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂对三种GST蛋白分离纯化的SDS-PAGE图，从泳道5-7可以看出，制备的Fe3O4/L-Cys-GSH磁性吸附剂对GST-tagged LOV、GST-tagged N2、GST-tagged GPX3三种蛋白均具有很好的特异性，说明制备的磁性吸附剂对GST-tagged蛋白具有普适性.

图7 Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附剂分离纯化三种GST-tagged蛋白的SDS-PAGE图：泳道1，Maker；泳道2，GST-tagged LOV混合蛋白；泳道3，GST-tagged N2混合蛋白；泳道4，GST-tagged GPX3 混合蛋白；泳道5，Fe3O4/Cys-GSH复合微球对GST-tagged LOV分离纯化；泳道6，Fe3O4/Cys-GSH复合微球对GST-tagged N2分离纯化；泳道7，Fe3O4/Cys-GSH复合微球对GST-taggedGPX3分离纯化Fig.7 Fe3O4/Cys-GSH magnetic adsorbent of three GST-tagged protein purified SDS-PAGE: Lane 1, Marker; Lane 2, GST-tagged LOV E. coil lysate; Lane 3, GST-tagged N2 E. coil lysate; Lane 4, GST-tagged GPX3 E. coil lysate. The fractions washed off from the Fe3O4/Cys-GSH when different kinds of GST-tagged proteins were used (Lane 5, GST-tagged LOV; Lane 6, GST-tagged N2; Lane 7, GST-tagged GPX3)

3 结论

以磁性Fe3O4/Cys纳米微球为载体，通过表面生物功能化后，得到Fe3O4/Cys-GSH磁性亲和吸附剂，可直接应用于混合蛋白中GST-tagged融合蛋白的分离、纯化. 实验结果表明，制备的磁性纳米微球对GST-tagged蛋白具有特异性，可快速、高效地对目标蛋白进行分离，且重复使用性能良好，具有潜在的市场应用价值.

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SeparationandpurificationofGST-taggedproteinbymagneticnanoadsorbent

ZOU Xueyan1, SUN Xin2, QIN Mingming1, DONG Shuo1, ZHANG Yutao1, CAO Pengle1, LI Qiangwei2, CHAI Yun2*

(1.EnginerringResearchCenterforNanomaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Using Fe3O4/Cys as a carrier, Fe3O4/Cys-GSH nano adsorbent was obtained by modifying glutathione (GSH) group, which could be applied to the affinity separation of GST-tagged fusion protein. The results show that the prepared Fe3O4/Cys-GSH nano adsorbent has the specificity, universality and reusability to the GST-tagged fusion protein, and can realize the rapid and efficient separation of the target protein. A potential application value would be expected.

Fe3O4;L-cysteine; affinity separation; GST-tagged

O61

A

1008-1011(2017)05-0617-05

2017-06-13.

国家自然科学基金(21571051), 河南大学科研基金项目(2015YBZR032), 河南省科技创新杰出人才支持计划(164200510005), 河南省高校科技创新团队支持计划(17IRTSTHN004), 济源市科技发展计划项目(170220).

邹雪艳(1981-), 女, 讲师, 研究方向为复合纳米材料的制备及其对蛋白质的亲和分离.*

,E-mail:chaiyun@henu.edu.cn.

[责任编辑：张普玉]