锌离子对缓冲液中槲皮素和牛血清白蛋白相互作用的影响

付彩霞，王继超，高宗华

（滨州医学院 化学教研室，山东 烟台264003）

锌离子对缓冲液中槲皮素和牛血清白蛋白相互作用的影响

付彩霞，王继超，高宗华

（滨州医学院 化学教研室，山东 烟台264003）

采用荧光光谱法和紫外光谱法研究了Zn2＋离子对槲皮素（Qct）和牛血清白蛋白（BSA）在pH＝7.4的Tris－HCl缓冲溶液中相互作用的影响；根据荧光猝灭双倒数图计算了Qct和BSA之间的结合常数和结合位点数.结果表明，Qct和Zn2＋离子都可以使BSA的荧光强度发生猝灭；Qct和BSA之间的结合常数为3.17×107L·mol－1·s－1，结合位点数为1.32.定量计算表明，加入Zn2＋离子后，Qct与BSA间的结合常数显著降低、结合位点数减小，表明Zn2＋离子参与了Qct与BSA的结合过程.

锌离子；槲皮素；牛血清白蛋白；相互作用

槲皮素（Quercetin，Qct，结构见图1）是存在于多种植物中的多羟基黄酮类化合物，具有防治心血管疾病、增强免疫、抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒等功能[1－5]，受到人们的广泛关注.Zn2＋离子是较强的Lewis酸，其含量在生物体内微量金属中居第二位，它对蛋白质的物质转运、结构支撑等有直接作用.人体缺锌会引起伤口不易愈合、皮肤及黏膜溃疡、嗅觉迟钝、发育不良，并直接影响骨骼发育.

图1 Qct的化学结构Fig.1 Chemical structure of quercetin

作者在模拟人体生理pH条件下，用荧光光谱法和紫外光谱法研究Qct与BSA相互作用，探讨了Zn2＋离子存在下Qct与BSA间结合常数的变化，阐明了Zn2＋的浓度对Qct和BSA结合作用的影响.这对于更全面地了解药物在体内与白蛋白的结合情况具有重要意义.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

pH－3C酸度计（上海逸龙科技有限公司）；电热恒温水浴锅（上海实验仪器厂有限公司）；KQ－500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（美国奥豪斯OHAUS电子天平，AR1140）；LS－55荧光分光光度计（美国，PE公司）；TU－1901双光束紫外－可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）.

牛血清白蛋白（生化试剂，中国医药集团上海化学试剂公司），槲皮素（国药集团化学试剂有限公司）.用0.1mol·L－1pH ＝7.4的Tris－HCl（内含0.1mol·L－1NaCl维持离子强度）缓冲溶液配制浓度为1.18×10－6mol·L－1的牛血清白蛋白溶液；Qct用无水乙醇溶解配制成1.00×10－3mol·L－1的储备溶液；配制浓度为0.01mol·L－1的硫酸锌溶液，备用.实验用水为二次蒸馏水，经检测均无荧光杂质.

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱测定方法

在1cm比色皿中加入3.00mL 1.18×10－6mol·L－1的BSA溶液，用微量注射器逐次加入1.00×10－4mol·L－1的Qct溶液进行荧光滴定，摇匀，静置5min，21℃下扫描荧光光谱，激发波长为280nm.固定BSA和Zn2＋离子的浓度，改变Qct的浓度，扫描荧光光谱.

1.2.2 紫外光谱测定方法

固定Qct的浓度为1.00×10－4mol·L－1，改变Zn2＋离子的量，以试剂空白为参比，记录21℃下在200～400nm待测溶液的紫外吸收光谱.

2 结果与讨论

2.1 Qct和Zn2＋离子对BSA的猝灭作用

以λex＝280nm，在300～500nm范围内，在BSA溶液中分别加入相同浓度的Zn2＋离子和Qct溶液后，BSA的最大荧光峰位置没有发生变化，但荧光强度均有一定程度的降低（见图2），其中Zn2＋的加入使BSA荧光降低的程度较缓，而相同浓度的Qct使BSA的荧光显著降低，Zn2＋离子与Qct共同存在下BSA的荧光强度下降得更加明显.表明Qct和Zn2＋离子分别与BSA发生了相互作用.

图2 Zn2＋和Qct存在下BSA的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the presence of Qct and Zn2＋

2.2 Qct和BSA的结合作用

由表1可见随着Qct浓度的增大，F0/F的数值也增大，即BSA的最大荧光发射峰强度逐渐降低，表明Qct的加入对BSA有荧光猝灭作用.

荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭、静态猝灭.动态猝灭和静态猝灭作用可分别用Stern－Volmer方程计算[6－7]，即F0/F＝1＋KSV[Q]＝1＋Kqτ0c（Qct），式中F0和F为猝灭剂不存在和存在时蛋白的荧光强度（单位a.u.），c（Qct）为猝灭剂浓度（单位 mol·L－1），KSV为猝灭常数（单位L·mol－1），τ0为蛋白荧光寿命（单位s），生物大分子的平均寿命约为10－8s[8]，Kq为双分子猝灭过程的速率常数（单位L·moL－1·s－1）.以F0/F对c（Qct）作出Qct对BSA的荧光猝灭图.

表1 Qct对BSA荧光强度的影响Table 1 Effect of Qct on fluorescence intensity of BSA

图3中曲线有很好的线性关系.文献表明，各类猝灭剂对生物大分子荧光的作用，其最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010L·mol－1·s－1[9].根据实验所得KSV＝5.17×105L·mol－1，可以算出 Qct对BSA的荧光猝灭速率常数Kq＝5.17×1013L·mol－1·s－1，远大于2.0×1010L·mol－1·s－1.由此可推断，Qct对BSA荧光的猝灭不是动态碰撞引起的，而是由于药物和蛋白形成了配合物而导致的静态猝灭，表明Qct与BSA分子间形成了二元配合物.这一结论，与文献报道一致[10].

根据静态猝灭理论和lg（（F0－F）/F）＝lgK＋nlgc（Qct），K为药物与白蛋白分子的结合常数（单位L·mol－1），n为结合位点数.以lg（（F0－F）/F）对lgc（Qct）作图，得图4.由图4斜率得结合常数为K＝3.17×107L·mol－1·s－1，结合位点数n＝1.32，线性相关系数R＝0.986 8，可见 Qct和BSA之间具有较强的结合作用.

图3 Qct对BSA的Stern－Volmer荧光猝灭曲线Fig.3 The Stern－Volmer curves of fluorescence quenching of BSA by Qct

图4 lg（（F0－F）/F）对lgc（Qct）的关系图Fig.4 The plot of lg（（F0－F）/F）against lg c（Qct）

2.3 Zn2＋离子存在下Qct对BSA荧光的影响

为了进一步探讨Zn2＋离子对Qct与BSA结合作用的影响，研究了在三种不同浓度Zn2＋离子的存在下Qct与BSA之间的结合常数K和结合位点数n的变化情况，结果见表2.

表2 不同浓度Zn2＋离子存在下Qct与BSA的结合常数及结合位点数Table 2 Binding constants（K）and number of binding sites（n）of Qct and BSA in the presence of different concentration of Zn2＋ion（pH ＝7.4；c（BSA）＝1.0×10－6 mol·L－1）

表2结果表明，随着Zn2＋离子浓度的增大，Qct与BSA的结合常数和结合位点数均显著降低.这可能由以下两个原因所导致：（1）Zn2＋离子能够与BSA的氨基酸残基发生结合，部分占据了Qct与BSA原来结合的位点.（2）Qct充当了Zn2＋离子的配体，与Zn2＋离子发生结合，生成了锌配合物，所形成的配合物具有不同于Qct所拥有的分子构型、体积、刚柔性、亲水疏水性等性质，使其难以进人BSA的疏水腔而与色氨酸残基结合，从而导致了与BSA的结合常数、结合位点数变小.

2.4 Zn2＋与Qct溶液的紫外光谱

上述结果表明，在Tris－HC1缓冲溶液体系中Zn2＋离子显著影响Qct与BSA的结合.为探明在Qct与BSA的作用过程中Zn2＋离子仅仅发挥了协同作用还是与Qct形成了新的配合物而产生的影响，采用紫外吸收光谱法进一步探索了Zn2＋离子与Qct的结合.Qct在紫外区均有2个吸收带：375nm和255nm，前者是由B环（图1）桂皮酰基的电子跃迁引起的吸收，后者是由A环（图1）苯甲酰基的电子跃迁引起的吸收[11].从图5可以看出Zn2＋离子的加入使Qct的紫外吸收带发生了红移，光谱形状也发生了较大的变化.该结果表明，Zn2＋与Qct发生了结合，形成了Qct－Zn2＋配合物.

图5 Zn2＋离子存在下Qct的紫外光谱变化Fig.5 Variation of the ultraviolet spectra of Qct（100μmol·L－1）in the presence of Zn2＋ion

3 结论

用荧光法较详尽地研究了Zn2＋离子存在下Qct与BSA的相互作用.结果表明，Qct和Zn2＋离子都能使BSA的荧光发生猝灭，并且Zn2＋离子的加入则进一步导致了BSA的荧光猝灭.定量计算表明，加人Zn2＋离子后Qct与BSA间的结合常数显著降低、结合位点数减小，并且随着Zn2＋离子浓度的增大，Qct和BSA的结合能力减弱.紫外光谱显示，Zn2＋离子与Qct发生了配位反应，形成了新的配合物.可以推断，在Zn2＋离子存在下，Qct与BSA的结合在很大程度上是Qct的锌配合物与其相互作用.

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Effect of zinc ion on interaction between quercetin and bovine serum albumin in buffer solution

FU Cai－xia，WANG Ji－chao，GAO Zong－hua
（TeachingandResearchSectionofChemistry，BinzhouMedicalCollege，Yantai264003，Shandong，China）

The effect of Zn2＋ion on the interaction between quercetin（Qct）and bovine serum albumin（BSA）in Tris－HCl buffer solution（pH ＝ 7.4）was investigated by means of fluorescence spectrometry and ultraviolet spectrometry.The binding constant（K）and number of binding sites（n）of Qct and BSA were calculated according to Stern－Volmer equation and double－reciprocal equation.Results show that both quercetin and Zn2＋ion can quench the fluorescence intensity of BSA.In the system of binary complex of Qct and BSA，K＝3.17×107L·mol－1·s－1andn＝1.32.Quantitative calculation shows that the binding constant and the number of binding sites of Qct and BSA decrease in the presence of Zn2＋ion.This indicates that Zn2＋ion has taken part in the combining process between Qct and BSA.

zinc ion；quercetin；bovine serum albumin；interaction

O 657.3

A

1008－1011（2012）01－0060－04

2011－08－12.

山东省教育厅科技计划项目（J08LG15）.

付彩霞（1963－），女，副教授，硕士，主要从事金属有机化合物的合成与研究.