线性扫描伏安法研究大豆甙元与牛血清白蛋白的相互作用

尚永辉,孙家卷,刘 彬,黄 怡,赵 维

(咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳 712000)

图1 大豆甙元的结构式Fig.1 Molecular structure of daidzein

蛋白质与药物小分子发生相互作用所生成的超分子化合物无论在光学性质和电化学性质方面均有异于蛋白质与药物单体[1]，光谱方法以及电化学方法均可应用于研究蛋白质与药物分子之间的相互作用信息[2-3]. 相对于光谱分析方法而言电化学分析方法具有仪器设备简单，取样量少，选择性高等诸多优点，此外电化学分析过程不受生物样品的浑浊及其样品颜色等的干扰；能为进一步探讨蛋白质的亚层结构变化和生理作用等提供重要的信息[4]. 电化学分析方法已成为目前研究生物大分子与药物分子相互作用的常规方法之一.

大豆甙元(daidzein)属黄酮类化合物(结构见图1)，具有扩张血管，抗心律失常，降低血压等多种药理作用[5]，本文作者采用线性扫描伏安分析方法研究了大豆甙元与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用信息，并在此基础上对相互作用的机理进行了简单的分析推测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学工作站(上海辰华仪器有限公司生产，CHI660C型)(工作电极为玻碳电极；参比电极为饱和甘汞电极；对电极为铂电极)；pH计(上海雷磁仪器厂，pHSJ-4A型).

牛血清白蛋白(BSA，购自中国药品生物制品检定所)；大豆甙元(daidzein；对照品；购自中国药品生物制品检定所)；实验所用其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水.

BSA储备液的配制：称取0.006 6 g BSA于50 mL小烧杯中，用二次蒸馏水溶解完全并定容到100 mL容量瓶中，得到1.0×10-3mol·L-1BSA标准溶液，摇匀，于0～4 ℃的冰箱中保存，备用. 实验所需其他溶液由此储备液稀释得到.

大豆甙元储备液的配制：取0.002 5 g大豆甙元标准品于50 mL小烧杯中用二次蒸镏水溶解，并转移至100 mL容量瓶中，定容，得到1.0×10-4mol·L-1大豆甙元储备液，于0～4 ℃的冰箱中保存，备用.

1.2 实验方法

玻碳电极预处理：使用前首先在0.013 mm的金相砂纸上充分打磨，此后用α-Al2O3粉末在麂皮上抛光成镜面，再分别用水和乙醇各超声清洗5 min后用蒸馏水淋洗干净，用滤纸吸去多余的水分，备用[6].

依次取一定量的大豆甙元，缓冲溶液，BSA溶液分别于10 mL的比色管中，用二次蒸馏水定容至刻线；摇匀后取适量溶液于小电解池中，在0～-1.2 V电位窗口范围内进行线性伏安扫描(LSV)，记录相应的电位(E)-电流(I)曲线.

2 结果与讨论

2.1 大豆甙元与牛血清白蛋白的相互作用

按照1.2实验方法进行实验发现大豆甙元在B-R缓冲溶液中具有一灵敏的还原峰，峰电位在-0.83 V处，加入牛血清白蛋白后，峰电流值明显降低，而峰电位负移至-0.90 V处(如图2所示)，表明在实验条件下大豆甙元与BSA之间发生了某种相互作用.

v = 100 mV/s. a: 5.0×10-5 mol·L-1大豆甙元; b: 5.0×10-5 mol·L-1大豆甙元+1.0×10-7 mol·L-1 BSA图2 大豆甙元在B-R缓冲溶液中的线性扫描图Fig.2 LSV of daidzein and daidzein-BSA system

2.2 大豆甙元与BSA的相互作用的条件

2.2.1 底液对峰电流的影响

实验中考察了Na2HPO4-NaH2PO4，Tris-HCl，B-R等缓冲体系对大豆甙元峰电流Ip的影响. 结果发现缓冲底液对大豆甙元还原峰峰电流有较大影响，其中在B-R缓冲介质中还原峰峰电流Ip最大，且峰型最佳，实验选择B-R缓冲介质为底液进行研究.

2.2.2 pH对峰电流的影响

实验进一步考察了不同pH的B-R缓冲溶液对大豆甙元还原峰峰电流Ip的影响. 结果表明B-R缓冲溶液pH在4.5～6.5之间变化时，峰电流Ip随着pH的增大而逐渐增大；pH在7.0到7.5之间，峰电流Ip变化非常缓慢. 实验选择pH为7.4的B-R缓冲溶液为底液进行研究.

2.2.3 反应时间对峰电流的影响

实验考察了反应时间对BSA与大豆甙元相互作用程度的影响. 研究发现：反应时间小于18 min，大豆甙元还原峰峰电流Ip逐渐减小，表明两者相互作用正在进行；反应时间大于20 min以后，峰电流Ip变化趋于稳定，表明BSA与大豆甙元相互作用基本完全. 实验选择在大豆甙元与BSA反应时间20 min后进行研究.

2.2.4 温度对峰电流的影响

实验考察了反应温度对BSA与大豆甙元相互作用程度的影响. 研究发现：在B-R缓冲介质中，温度在292～313 K.之间变化时，混合体系峰电流Ip随温度的升高而增大，表明随着温度升高，BSA与大豆甙元相互作用生成的物质部分离解，导致相互作用程度减弱，体系中游离的大豆甙元量增加，导致峰电流Ip升高. 实验选择在290 K下进行研究.

2.2.5 扫描速率对峰电流的影响

实验进一步考察了扫描速率v对峰电流Ip的影响，研究发现：扫描速率v在0.10～0.80 V/s范围逐渐变化，峰电流Ip随扫描速率v的增大而逐渐增加，表明该电极反应过程具有一定的吸附性.

2.3 大豆甙元与BSA的相互作用机理的探讨

2.3.1 大豆甙元与BSA作用过程中转移系数及表观电子传递速率常数的测定

转移系数α是电化学研究中十分重要的一个动力学参数. 依据Laviron理论[7]，当所研究的对象是仅仅受到吸附过程控制的准可逆体系时，阴极峰峰电位Ep应遵循如下关系式：

EP=E0+(RT/αnF)ln(RTks/αnF)-(RT/αnF)lnv

该式表明还原峰峰电位Ep与扫描速率v的常用对数lnv呈线性函数关系，绘制Ep-lnv函数曲线，直线斜率为-RT/(αnF)，由此可求得转移系数α；进而根据曲线截距可求得表观电子传递速率常数ks[8].

在实验条件下，体系峰电位Ep与扫描速率v(v=0.05～0.6 V/s)的自然对数关系曲线方程为：Ep= -0.034 9 lnv-1.033 1，相关系数为0.999 5，依据峰电位Ep与扫描速率v的自然对数lnv的关系式，得知曲线斜率RT/(αnF)为-0.034 9，由此得到：αn= 0.735 8，考虑到大豆甙元为二羟基异黄酮，酚羟基的电化学反应过程已被广泛证明为双质子，双电子转移过程，取n=2,计算得出转移系数α= 0.367 9.

表观电子传递速率常数ks可由下式求算：

lgks=clg(1-α) +(1-α)lgα-lg[RT/(nFv)]-α(1-α)nFΔVp/(2.303RT)

根据公式计算，得出该电极反应的表观电子传递速率常数ks为1.39 s-1.

2.3.2 大豆甙元与BSA相互作用过程结合常数β和结合数m的求算

通过研究表明实验条件下大豆甙元(简写为F)与BSA相互结合形成了一种非电活性超分子化合物BSA-F，结合过程可用如下的关系描述：

根据上式，反应过程的结合常数可表示为：β=cBSA-mF/[(cF)mcBSA]

对该式进行进一步推导得到：

lg[ΔIp/(ΔIpmax-ΔIp)]=lgβ+mlgcF

公式中ΔIpmax为加入BSA前后大豆甙元溶液体系还原峰峰电流Ipa差值的最大值.

实验发现大豆甙元与BSA结合过程lg[ΔIp/(ΔIpmax-ΔIp)]与lgcF成线性关系，表明大豆甙元分子和BSA相互作用只形成了一种单一的缔合物，曲线的斜率为大豆甙元与BSA相互作用的结合数m，由实验数据得到m= 0.942 1 ≈ 1；曲线截距为大豆甙元与BSA结合常数的对数lgβ，通过计算求得β= 8.29×105L·mol-1.

参考文献：

[1] 李 锐, 任海平, 宋艳婷, 等. 小分子与生物大分子间非共价相互作用分析方法研究进展[J]. 分析化学, 2006, 34(12): 1801-1806.

[2] 刘 峥, 夏之宁. 光谱法在分子之间相互作用研究中的应用[J]. 激光杂志, 2001, 22(6): 9-11.

[3] CHAKRABORTY B, BASU S. Interaction of BSA with proflavin: a spectros copicapproac[J]. J Luminesc, 2009, 1: 34-39.

[4] SUN W, JIAO K. Linear sweep voltammetric determination of protein based on its interaction with alizarin red S[J]. Talanta, 2002, 56(6): 1073-1080.

[5] 延 玺, 李玉梅, 于 静, 等. 两种新型水溶性异黄酮衍生物的合成与抗氧化活性[J]. 化学学报, 2007, 65 (17): 1845-1850.

[6] 孙元喜, 冶保献, 周性尧. 聚中性红膜修饰电极的电化学特性及其电催化性能[J]. 分析化学, 1998, 26(2): 166-169.

[7] LAVIRON E. Adsorption, autoinhibition and autocatalysis in polaro-graphy and in linear potential sweep voltammetry[J]. J Electroanal Chem, 1974, 52(3): 355-393.

[8] 董绍俊, 车广礼, 谢远武. 化学修饰电极[M]. 第一版.北京: 科学出版社, 1995： 129.