碳纤维/磁性纳米颗粒/高分子共轴纤维复合支架构建及其对成纤维细胞的作用研究

时间：2024-09-03

刘青桥郝博雅刘文昊童元建周航刘健许海燕

0 引言

在生物材料引导组织修复的过程中，支架材料需要通过与细胞的相互作用，使细胞存活、增殖，进而产生细胞外基质，最终形成新的功能化组织，因此，支架材料的生物化学信号和物理性质等均会影响细胞的功能[1]。首先，支架材料特别是其表面必须具有良好的生物相容性，胶原、明胶等天然来源的高分子在生物相容性方面具有先天的优势。其次，材料的力学强度及其对细胞的力学刺激会显著影响修复相关细胞的功能，例如结缔组织中最主要的细胞之一成纤维细胞是力学敏感性细胞[2-3]，对成纤维细胞施加适当的力学刺激，可以促进细胞的增殖和胶原蛋白及多种细胞因子的分泌[4-5]。此外，支架的电传导性质对于组织再生也具有显著的促进作用，特别是在肌肉[6]、神经[7]等可兴奋组织的修复方面，其重要性已经被大量文献所证实。因此，研发能够在以上三个方面同时满足组织再生需求的支架材料具有重要意义和应用价值。

单一材料在生物学和力学性能等方面难以满足组织工程支架材料的多方面需求，因而将两种或多种材料制备成复合材料支架有望更好地模拟特定细胞的生长环境，是引导组织再生的有效策略。静电纺丝纤维具有类似于细胞外基质的微观结构，通过共轴纺丝技术，可以在纳米纤维表面形成生物相容性良好的表层结构。碳纤维具有优异的导电性和高比强度、高弹性模量，广泛应用于航空航天、新型建筑材料和高性能体育用品等领域[8-9]，但在组织工程领域，其仅在肌腱[10]、韧带[11]、骨[12]以及心肌组织[13]的修复方面有少量研究探索。将碳纤维用于组织工程支架有望同时改善材料的力学特性及导电性能。氧化铁磁性纳米颗粒在生物医学领域已得到广泛的研究与应用[14]。当其复合到生物材料支架中后，能够响应外加磁场并产生运动趋势，从而使支架产生局部微形变，对黏附和生长于支架上的细胞施加力学刺激[15]，是一种对细胞实施力学刺激的新手段。

基于上述研究背景，本文将共轴静电纺丝技术与冷冻干燥方法相结合，制备高分子共轴纤维/磁性纳米颗粒/碳纤维复合支架，对支架的微观形貌及电、磁、力学和热学性质进行表征和分析，并初步评价支架对成纤维细胞生长的作用。希望在生物相容性、力学强度与力学刺激、导电性三个维度上实现对支架材料功能优化。

1 材料与方法

1.1 材料

聚乳酸(polylactic acid，PLA，长春圣博玛生物材料有限公司)；A型明胶(gelatin,Gel,Sigma-Aldrich 公司)；四氧化三铁纳米颗粒(metal nanoparticle,MNP，南京东纳生物有限公司)；聚丙烯腈基碳纤维(carbon fiber,CF)，由北京化工大学国家碳纤维工程技术中心制备；三氟乙醇(2,2,2-trifluoroethanol，TFEA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；小鼠胚胎成纤维细胞 NIH-3T3 (中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记鬼笔环肽(上海翊圣生物科技有限公司)。细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁化学)。

1.2 方法

1.2.1 静电纺丝溶液配制

称取2.0 g明胶和4.0 g聚乳酸分别加入到20 mL三氟乙醇中，配制浓度为10%(质量浓度)的明胶溶液和浓度为20%(质量浓度)的聚乳酸溶液。将0.2 g MNP加入到10 mL三氟乙醇中，用超声处理辅助分散，再分别加入1.0 g明胶或2.0 g聚乳酸，充分溶解后得到含磁性颗粒的明胶溶液溶液和聚乳酸溶液。

1.2.2 电纺丝纤维薄膜制备

以聚乳酸溶液为芯层，明胶溶液为壳层，用静电纺丝机(YFSP-T，天津云帆科技有限公司)在室温下进行纺丝。参数为：接收距离约15 cm，电压20 kV，流速0.002 mm/s，旋转接收器转速150 r/min。将制备的薄膜室温真空干燥48 h，再于120 ℃下真空加热4 h，完成热交联。

1.2.3 复合支架制备

称取长度裁剪为约1 cm的碳纤维10 mg，加入到10 mL TFEA中，水浴超声30 min，并在磁子搅拌(150 r/min)下使碳纤维充分打碎分散，在光学显微镜下统计碳纤维的长度分布。将分散液置于通风橱内使TFEA完全挥发后，加入双蒸水并再次超声处理，使碳纤维重新分散在水中。将分散液转入模具中，放入-80 ℃冰箱冷冻。将冷冻成型的碳纤维冰片(厚度约6 mm)置于两层电纺丝纤维薄膜中间，转移至冷冻干燥机中冻干，得到三明治夹心结构的复合支架。

1.2.4 支架理化性质表征

将电纺丝纤维薄膜固定在导电胶上，通过扫描电子显微镜(SU-8010，日本)观察其微观结构。用Image-J软件随机选取100根电纺丝纤维，统计分析其直径分布。复合支架在室温双蒸水中浸泡12 h，吸走表面水分，使用四探针测试仪(Mitsubishi Chemical Loresta-GX MCP-T700，日本)在支架5个位置检测电导率。称取适量的支架样品，放入震荡样品磁强计(Lakeshore-7407，美国)的样品仓中，测定支架的磁滞回线。将支架裁剪成长度为100 mm、宽度为15 mm的长条，并测定支架的厚度。将上述样品在纯净水中浸泡30 min后，使用电子万能试验机(Shimadzu,SLBL，日本)测定拉伸强度和弹性模量。夹具间距为50 mm，拉伸速度为5 mm/min，每组3个平行，根据测试结果绘制应力-应变曲线并计算弹性模量。在差示扫描量热仪(Q2000)上测定材料的热行为，气氛为氮气，升温速度为10 ℃/min。

1.2.5 激光共聚焦显微镜观察

将支架材料裁剪成直径15 mm的圆片，置于玻片上并分别放入24孔板的各孔中。使用环氧乙烷灭菌，并抽真空48 h去除残余环氧乙烷。在各孔中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基对支架浸润6 h后，将NIH-3T3细胞接种到支架材料上(5×104个/孔)，于37 ℃培养6 d。使用4%的多聚甲醛/PBS溶液对细胞进行固定和透膜处理后，用FTIC标记的鬼笔环肽染色。使用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片剂封片，在激光共聚焦显微镜(FV1000+IX81，Olympus)下观察。

1.2.6 细胞活性实验

将支架材料裁剪成96孔板对应大小，每组材料3个平行。按1.2.5所述方法处理后，将NIH-3T3细胞以1×104个/孔的密度接种在支架上，并继续培养24 h。吸除旧培养基，并在每孔中加入100 μL 新鲜培养基和10 μL CCK8工作液，在37 ℃下孵育3 h。从各孔分别取90 μL上清液加入新培养板中，用酶标仪(Epoch,BioTek Instruments)检测其在450 nm处的吸光度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 电纺丝薄膜的形貌与微观结构

由聚乳酸及明胶溶液制备的共轴电纺丝纤维薄膜(PLA/Gel)为白色不透明薄膜；含MNP的薄膜(mag-PLA/Gel)为棕色不透明薄膜。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察可见，纤维表面光滑，呈无规缠结状态，相互交错的纤维形成了立体网状结构，内部为孔径约数微米的贯通孔隙，且纤维之间未见明显的融合(图1)。使用Image-J软件统计随机选取的100根纤维的直径，结果表明，PLA/Gel中纤维的直径分布在434～1225 nm之间，平均直径816 nm；mag-PLA/Gel中纤维的直径分布在468～1340 nm之间，平均直径866 nm，后者比前者的平均直径略大，但没有明显的差别，说明MNP的加入对纤维的直径没有显著影响。

图1 扫描电子显微镜观察复合支架的微观结构Figure 1 Microscopic observations of composite scaffolds by SEM

2.2 碳纤维形貌观察和复合支架的制备

将分散处理后的碳纤维在光学显微镜下观察[图2(a)]，并采用Image-J软件统计碳纤维的长度分布，结果表明，TFEA中碳纤维的长度范围为34～2439 μm，最大量的碳纤维分布在400～600 μm。碳纤维在高分子材料中的分散是一个具有挑战性的技术问题。本文采用的策略是将热交联后的纺丝纤维薄膜与冷冻成型的碳纤维冰片通过冷冻干燥组成具有“三明治”结构的复合支架(PLA/Gel/CF及mag-PLA/Gel/CF)，制备过程如图2(b)所示。通过扫描电镜观察夹层中碳纤维的分布和微观形貌，可见碳纤维均匀散布在电纺丝薄膜上，无取向性，且碳纤维之间有大量的搭接点。同时，可以观察到碳纤维表面具有大量均匀分布的沟槽，此表面结构有利于碳纤维与电纺丝纤维之间的相互黏附。上述结果表明，所采用的“三明治”结构制备方法能使碳纤维在支架中均匀分布，有利于增强材料的导电性及机械强度。

图2 导电支架的制备以及夹层中的碳纤维Figure 2 The preparation of composite scaffolds and the carbon fibers in scaffolds

2.3 复合支架的电磁学性质

用四点探针仪检测双蒸水(deuterium depleted water,DDW)浸泡后的各支架电导率，结果表明，PLA/Gel、PLA/Gel/CF、mag-PLA/Gel、mag-PLA/Gel/CF四种支架的电导率分别为0、14.4、21.9和36.5 mS/m，而双蒸水的电导率为7.67 mS/m(图3)。由此可见，无论是碳纤维还是磁性纳米颗粒的加入，均可改善PLA/Gel的电传导性；当支架中同时引入碳纤维和磁性纳米颗粒后，电传导性得到了进一步的提高。与此同时，可以看到磁性纳米颗粒的引入使支架获得了超顺磁响应性，mag-PLA/Gel和mag-PLA/Gel/CF的最大饱和磁化强度为2.64 emu/g和2.29 emu/g。虽然碳纤维的加入使支架的超顺磁响应性略有减弱，但是支架同时获得了电传导性和超顺磁响应性。

图3 复合支架的电磁性质表征Figure 3 Characterizations of the conductivity and superparamagnetic property of composite scaffolds

图4 复合支架的力学性质和热行为Figure 4 Mechanical properties and thermal behavior of composite scaffolds

2.4 复合支架的力学性质和热行为

为了模拟复合材料在细胞实验中的力学性质，使用电子万能试验机检测了支架在吸水湿润状态下的弹性模量。通过应力-应变曲线的线性区域计算得到PLA/Gel、PLA/Gel/CF、mag-PLA/Gel、mag-PLA/Gel/CF 四种支架的弹性模量分别为16.4、18.8、27.2和32.1 MPa(图4)。以上结果表明，碳纤维或磁性颗粒的加入，均可提高支架的弹性模量。明胶属于低模量的水凝胶材料，尽管共轴纤维具有聚乳酸芯，但其模量通常难以满足肌肉或结缔组织对支架的要求，因此，碳纤维和磁性纳米颗粒的加入不仅赋予了之间电磁学性质，而且显著提高了支架的模量。由差示扫描量热分析的结果也可以看到，碳纤维的加入对复合支架的熔融行为有比较明显的影响，使熔融温度有所提高，并且熔融温度范围变宽，说明高分子的长程运动受到一定的限制，从一个侧面反映了碳纤维与高分子纤维之间存在界面相互作用。与此同时，可以注意到磁性纳米颗粒的加入对材料的玻璃化转变有一定的影响，说明磁性纳米颗粒与高分子之间存在短程相互作用。

2.5 复合支架对成纤维细胞生长的影响

为观察小鼠胚胎成纤维细胞在PLA/Gel和mag-PLA/Gel/CF上的生长情况，使用FITC标记鬼笔环肽(绿色荧光)和DAPI(蓝色荧光)对细胞骨架和细胞核进行染色，通过激光共聚焦显微镜观察可以看到，在两种支架上生长6 d后，细胞在材料表面分布均匀，形态正常；与PLA/Gel上的细胞相比，生长在mag-PLA/Gel/CF复合支架上的细胞骨架蛋白F-actin的表达水平显著升高，且骨架纤维更具张力[图5(a)]，说明复合支架对成纤维细胞的生长更为适宜。此外，细胞活性实验结果显示，细胞在不同支架上均能正常生长，所制备的复合支架表现出良好的生物相容性[图5(b)]。

图5 复合支架对成纤维细胞生存的影响Figure 5 Effects of composite scaffolds on the survival of fibroblasts

3 讨论

生物材料已被证明可以促进细胞的生长、增殖和分化，广泛用于骨、神经和骨骼肌组织的再生与缺损修复研究中[16]。导电高分子[17]、金属纳米材料[18]和碳纳米材料[19-20]是三类常用的导电生物材料，在碳纳米材料中，碳纳米管和石墨烯是研究最多的两种。碳纤维的直径为7 μm，与碳纳米材料不同的是，碳纤维在具有高导电性的同时，还具有高强度和高模量，可以赋予组织再生用支架材料多种性能，展现出其在可兴奋组织和高模量组织中的应用潜力。磁性纳米颗粒也为支架材料带来了新的性能，不仅改善支架的电传导性和提高了弹性模量，而且赋予了支架超顺磁响应性，这一特性使其可以与外加磁场联合，对支架上的细胞直接施加力学刺激，促进细胞功能[21-22]。与此同时，利用共轴静电纺丝技术获得的纳米纤维表层为生物相容性良好的明胶，同时内部的PLA可以提高纤维的机械强度，且三明治结构使碳纤维处于支架材料内部，减少了其与细胞直接接触可能引发的异物反应。因此，所制备的电磁复合支架表现出良好的细胞相容性。以上研究结果为后续深入开展细胞生物学研究和动物体内实验奠定了重要的材料基础。