生物瓣抗钙化检测方法研究

时间：2024-09-03

于秋航段苏然杨柳姜爱莉付海洋王召旭

0 引言

心脏瓣膜疾病是全球最常见的疾病之一，而心脏瓣膜置换手术是心脏瓣膜疾病的主要治疗策略[1]。动物源性生物瓣移植后，不需要接受长时间的抗凝治疗，且由于异种生物瓣膜来源于动物，供体充足，可提供多尺寸的瓣膜[2]，因此被广泛应用于临床置换手术中。但是对于植入后的生物瓣膜由于材料中的细胞残留、游离醛残基[3]等因素，以及连续的机械应力刺激[4]和免疫反应等的影响，会发生钙化问题，进而导致其弹性、韧性以及机械强度都发生很大变化[5]，失去原本的生理功能。所以，对生物瓣进行前期的抗钙化性能评价尤为重要。

抗钙化性能是评价产品安全有效的一个重要指标。GB 12279—2008《心血管植入物人工心脏瓣膜》中提出了对植入心脏和循环系统替代物的抗钙化性能检测要求，但目前缺少检测方法的相关标准。为解决没有相关方法学标准的问题，本研究以人工生物心脏瓣膜为样品，经过大鼠皮下植入、微波消解处理，以得到的检验液为研究对象[6]，研究生物材料中钙含量检测方法。当前钙含量常用的测定方法主要有火焰原子吸收分光光度(flame atomic absorption spectrophotometry，FAAS)法[7]、EDTA滴定法[8]、高锰酸钾滴定法[9]与电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-OES)法[10]等，其中FAAS法和ICP-OES法具有较高灵敏度、操作简单等特点，适用于日常的元素测定工作中。本研究对FAAS与ICP-OES两种检测方法进行方法学验证研究，以探究FAAS法与ICP-OES法应用于生物材料钙含量检测的可行性，为生物组织中钙含量的测定提供新思路，为制定相关抗钙化性能检测方法标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与材料

未经抗钙化处理的牛心包瓣膜材料和经过抗钙化处理的牛心包瓣膜材料。

健康SPF级3周刚断乳Wistar雄性大鼠20只，体质量46～56g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0006。

1.1.2 主要试剂与仪器

舒泰[(2015)外兽药证字43号]，法国维克有限公司；1000 μg/mL钙标准储备液(GSB G 62012-90)，国家钢铁材料测试中心、钢铁研究总院；氧化镧(99.99%)、硝酸(优级纯)、盐酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

MKⅡ M6原子吸收分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；PlasmaQuant 9000电感耦合等离子体发射光谱仪(德国Analytikjena公司)；Multtiwave 3000超高压微波消解系统(美国Anton Paar公司)；SHELLAB SMO高温烘箱(美国Brookfield公司)

1.2 方法

1.2.1 样品制备及检验液的制备

将植入大鼠皮下8周的样品取出，清除表面的宿主组织，80 ℃干燥至恒重，微波消解后，将检验液完全转移至25 mL容量瓶并用去离子水定容至刻度，作为检验液。

1.2.2 标准曲线绘制

FAAS法标准曲线：以1%硝酸定容，配制钙浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的标准曲线系列溶液，溶液中镧的质量浓度为2 g/L。以钙质量浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。

ICP-OES法曲线：以1%硝酸定容，配制钙浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的标准曲线系列溶液。以浓度质量(X)对光谱强度值(Y)绘制标准曲线。

1.2.3 仪器工作参数

FAAS仪器参数：检测波长422.7 nm，灯电流9.0 mA，火焰类型为空气乙炔型，燃料为空气(3.5 L/min)和乙炔(1.5 L/min)。

ICP-OES仪器参数：检测波长317.933 nm[11]，功率1200 W，等离子气流量15.0 L/min，辅助气流量0.5 L/min，雾化器流速0.5 L/min，蠕动泵转速1.0 mL/min，读取时间3 s，轴向的观测方式，载气99.996%高纯氩气。

1.2.4 评价指标及方法

(1) 专属性。专属性是指样品测定时在其他可能存在成分的干扰下，该分析方法能够准确地、选择性地识别检测待测物质的能力，主要考察杂质及其他成分对于待测物质测定结果的影响，可通过空白实验来考察。在特征波长下，试剂空白溶液的吸光度或光谱强度值与去离子水无差异，则可以认为该分析方法测定钙的专属性高。

(2) 线性范围。范围是分析方法达到精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度的区间。在该浓度范围内待测物质含量与仪器响应值成线性关系，标准曲线的相关系数r2值越接近于1，则说明两者之间的相关度越高。FAAS法与ICP-OES法测定时，相关系数应不小于0.99[12]。

(3) 检测限与定量限。检测限(limit of detection，LOD)是指待测液中被测物质能被检出的最低量，检测限仅作为限度实验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。在该实验中，检测限仅作为两种方法进行对比的一个参考数据，无定量意义。定量限((limit of quantitation,LOQ)是指试样中被测物质能被定量测定的最低浓度。两个参数常用LOD=3.3SD/S公式与LOQ=10SD/S公式进行计算，其中SD为响应值的偏差，S为标准曲线的斜率。本试验中应用两种方法分别测定20份试剂空白溶液，结果通过计算得到各自方法的检测限与定量限。

(4) 重复性和精密度。在规定范围内，取同一浓度的待测液，用至少6份的测定结果进行评价，记录测定结果，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。精密度是指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经过多次测定所得结果之间的接近程度，一般用相对标准偏差表示。RSD越小说明重复性与精密度越好。

(5) 准确度。准确度是指用建立的方法进行测定，测定结果与真实值或参比值接近的程度，一般使用回收率(%)表示。在规定范围内设置3种不同浓度，每种浓度至少3份的检验液进行测定。回收率越接近100%，说明该方法的准确度越高。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS软件对结果进行均值独立样本t检验和配对样品t检验。

2 结果与分析

2.1 检测方法的专属性

分别使用FAAS法与ICP-OES法对空白溶剂(去离子水)、试剂空白(1%硝酸溶液)、最低浓度标准溶液进行测定，响应值见表1。FAAS法与ICP-OES法分别测定的空白试剂与试剂空白响应值采用SPSS软件进行均值独立样本t检验，结果显示FAAS法P=0.078、ICP-OES法P=0.164，空白试剂与试剂空白响应值差异均无统计学意义。该结果说明建立的两种方法均受试剂中其他可能存在成分的干扰影响小，专属性良好。而标准曲线最低点响应值信号与试剂空白响应值信号差异具有统计学意义，说明了标准溶液在两种方法设定的波长处均有最大响应值，可以对待测物质进行测定。

表1 专属性试验结果Table 1 Results of specificity

2.2 线性范围、检出限与定量限试验

两种方法均平行制备20份空白样品，根据描述方法对样品进行测定，并分别计算LOD与LOQ，结果见表2。当钙含量浓度范围为0～5.0 μg/mL时，两种方法的线性关系良好，相关系数均满足最低要求的0.99，说明待测物质含量与仪器响应值相关度高，可作为两种方法的测定范围。两种方法的检出限与定量限存在差异，这与FAAS法的响应信号值较小有关。结果说明ICP-OES的定量线更低，比目前常用的FAAS法表现更好。但经验显示，实际测定时的检验液钙含量基本不会低于0.1μg/mL，因此该参数的差异对两种方法用于测定生物材料钙含量时影响不大。

表2 线性范围、检出限和定量限Table 2 Linear range，limit of detection and limit of quantitation

2.3 重复性和精密度试验

2份样品分为6份，分别用两种方法进行测定，得到两种方法的6次平行样品检验液的平均值，结果见表3。从试验的重复性和精密度方面看，这两种方法均能满足《中国药典》2020版四部通则 9101分析方法验证指导原则[12]中RSD≤3%的要求，说明两种方法的重复性和精密度良好。

表3 重复性试验结果Table 3 Results of repeatability test

2.4 回收率试验

设计3种不同浓度，用9份样品的测定结果进行评价。高、中、低样品加标量与所测样品检验液中钙测定浓度之比控制在1.5∶1、1∶1、0.5∶1范围内。FAAS法加标回收率均值为97.90%(n=9)，RSD为1.633%。ICP-OES法加标回收率均值为99.6%(n=9)，RSD为3.314%。采用SPSS软件对两种方法的回收率进行均值独立样本t检验，P=0.042<0.05，显示两组数据的差异具有统计学意义，ICP-OES法较FAAS法回收率更高，测定更加准确。两种方法的回收率试验结果均能满足《中国药典》2020版四部通则 9101分析方法验证指导原则[12]中要求的90%～108%加标回收率。

2.5 样品的测定

对照组和试验组各取3份检验液，每种检验液分别采用FAAS法和ICP-OES法上机进行测定，结果见表4。将两种方法对钙含量测定的结果进行配对样品t检验P=0.475>0.05，显示两种方法测定的结果无显著性差异，由此说明FAAS法与ICP-OES法均可以用于生物材料钙含量的测定。

表4 样品钙含量的测定结果Table 4 Determination results of calcium content in samples

3 讨论

目前，在生物组织钙含量的测定中，文献报道的国内外大多数研究人员选择的是FAAS检测方法，这种方法适用范围广泛，仪器较为普及，但测定钙含量所受干扰较多，需要加入抗干扰剂如镧溶液[13],而ICP-OES法无需加入抗干扰剂，较为简便快捷，但目前该仪器普及率不高，鲜有其应用于生物材料钙含量测定的相关研究报道；该方法具有检测灵敏度高、专属性强的优势应具有更广阔的应用空间。查阅现有的国家标准，笔者发现FAAS法和ICP-OES法目前多应用于金属、矿石等方面的元素分析中，缺少其应用于生物材料中钙含量检测的相关数据资料。生物材料与金属、矿石等物质成分不同，其检验液中可能存在的物质是否会对钙含量测定产生影响也需相关试验探究。本研究结果证实两种方法在测定生物瓣检验液中钙含量的回收率表现均良好，说明两种方法的测定结果准确性高、可信度好。

作为标准方法，其线性范围、检出限与定量限必须能够满足实际应用中检测样本的要求。经过长期对大量样品的测定，可以发现样品组经过前处理后检验液钙浓度基本落在0～5.0 μg/mL范围内，且在该范围内两种方法的线性良好，相关系数均大于0.999。检测限与定量限的结果显示FAAS法的定量限为0.060 μg/mL，较ICP-OES定量限0.0048 μg/mL高，说明在极低浓度下，FAAS法的表现不如ICP-OES法，而极低浓度下ICP-OES测定的结果却仍然具有较高的可信度。而在实际测定时，检验液钙含量基本不会低于0.1 μg/mL，因此两者的定量限均满足对生物瓣钙含量测定的基本要求。

作为标准中的方法，其重复性、精密度以及回收率都要满足一定要求，考虑到检测对象是医疗产品，本研究中以《中华人民共和国药典》作为参考依据，重复性试验中两种方法的RSD均满足药典[12]要求的3%以内。通过设置低、中、高3个加标梯度，FAAS平均回收率97.90%、RSD 1.633%，ICP-OES法平均回收率99.6%、RSD 3.314%，表明两种方法的回收率试验结果均能满足药典[12]所要求的90%～108%加标回收率，说明测定结果真实可靠。对比两种方法的回收率高低可以得出，ICP-OES法的准确性更好，可信度更高。

为了研究两种方法之间测定结果的差异，本研究分别用两种方法对同一样品进行检测并进行了统计学配对t检验，检验结果显示在本试验设计的线性范围内，两种方法测定的结果差异无统计学意义。

在实际操作中，FAAS法测定时需要加入掩蔽剂来减少干扰，较为繁琐，但该方法可在仪器读取钙含量数值之前利用吸光度对钙含量进行预估，即测定过程灵活，更适用于预测钙含量高低而进行的检测。ICP-OES法无需加入干扰剂，更为简便、快捷，但不能预估检验液的钙含量，因此该方法更适用于钙含量范围可以预估的大量样品的日常检测工作。