离子液体中结晶分离熊果酸和齐墩果酸研究

高意，曹亚慧，范杰平

（南昌大学资源环境与化工学院，江西南昌330031）

引 言

齐墩果酸（oleanolic acid,OA）与熊果酸（urso1ic acid,UA）互为同分异构体（化学结构如图1 所示），它们药理作用相似，均具有抗肿瘤[1]、抗炎[2]、保肝[3]、降血糖[4]、调血脂、免疫调节[5]、抗氧化[6]等药理作用，表现出广泛的应用前景。但是有研究表明这对同分异构体在质和量上常表现出不同的药效[7]，同时它们的性质非常相近，分离很困难。文献中有报道利用模拟移动床装置分离熊果酸和齐墩果酸[8]；或利用甲酸/过氧化氢或间氯过氧化苯甲酸与齐墩果酸反应生成三种与熊果酸结构有较大差异的化合物，再通过色谱法进行分离[9]。但这些分离方法对分离设备要求高，工艺复杂，不利于大规模的工业生产，所以必须探索出一种高效、经济的分离方法，以促进OA和UA在临床治疗上的应用。

图1 OA与UA的化学结构Fig.1 Chemical structure of OA and UA

结晶分离是利用混合物中各组分在溶剂中的溶解度不同或各组分溶解度随温度变化趋势不同而实现分离，是一种很重要的分离纯化技术，在生物技术、化工和医药等领域应用广泛[10-12]。离子液体是一种绿色非分子型溶剂，拥有独特的物理化学性能，被广泛应用于分析化学、电化学、药物结晶分离以及有机合成等领域[13-18]。有研究表明，在结晶过程中，离子液体不仅能替代常规溶剂，而且具有很多优越性能[19]，如离子液体具有较宽的液态温度范围，有利于多晶型设计；离子液体有时还可提高药物分子的稳定性。

近年来，作者团队及其他课题组研究了UA 和OA 在乙醇、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯、不同浓度乙醇和不同浓度氢氧化钠+乙醇+水混合溶剂等不同体系中的溶解度[20-23]，但UA 和OA 在这些常规溶剂中的溶解度都比较小，这无疑会降低结晶分离效率。

针对上述问题，本文测定了UA 和OA 在六种离子液体+乙醇溶液中的溶解度数据，六种离子液体包括1-乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-辛基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸。最后以1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液为结晶溶剂，对结晶分离工艺进行了初步优化。

所测溶解度数据可为结晶分离OA 和UA 奠定理论基础，并且利用离子液体+乙醇混合溶液作为溶剂结晶分离OA 与UA 是一种绿色、高效、经济的分离方法，可为结晶分离其他物质提供重要参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

UA和OA，均购自南京清韵生物科技有限公司。乙醇（分析纯），由西陇科学股份有限公司提供，纯度＞99.7%。1-乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸，1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，1-辛基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸，均购自林洲市科能材料科技有限公司，纯度皆大于99%，结构如图2所示。其余试剂皆为分析纯。

图2 六种离子液体结构Fig.2 The chemical structure of six ionic liquids

1.2 实验设备

低温恒温反应浴（带有磁力搅拌），DFY-5L/40型，巩义市予华仪器有限公司；Agilent 1100 高效液相色谱仪（配有四元泵及自动进样器，DAD 检测器），美国安捷伦公司；电子天平，FA2104型，上海伦捷机电仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高效液相色谱法（HPLC）检测方法 参考作者前期研究结果[20-22]，利用HPLC方法对UA和OA进行定量分析。色谱条件选定为：Hypersil ODS 色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，柱温30℃，流动相为乙腈∶水=90∶10，流动相流速为1 ml/min，检测波长λ=210 nm。

1.3.2 UA 和OA 在不同离子液体+乙醇混合溶液中溶解度的测定 参考作者前期研究方法[20-22]，利用平衡法测量UA 和OA 在六种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度，溶液中离子液体的质量分数均为5%。具体步骤如下。

（1）向西林瓶中加入一定量的离子液体+乙醇混合溶液，放入磁力搅拌子。

（2）将过量的UA 和OA 分别加入西林瓶中，先后用橡皮盖、封口膜和防水胶带密封。

（3）将西林瓶置于低温恒温反应浴中，设定一定温度，持续搅拌48 h。

（4）关闭磁力搅拌，静置12 h，用预先称重的注射器，安装滤头并预热后取样，对含有样品饱和溶液的注射器进行称重。通过差减得到所取饱和溶液的质量。

（5）饱和溶液注入容量瓶，并用乙醇反复洗涤，洗涤液也一并加入容量瓶，最后用乙醇定容，利用HPLC测定UA或OA的含量。

（6）根据式（1）计算UA 和OA 在饱和溶液中的溶解度（摩尔分数）。每个数据点取3 个样，所有溶解度数据的相对不确定度都在10%以内。

式中，x 表示UA 和OA 的溶解度（摩尔分数），m表示UA 或OA 在饱和溶液中的质量，M 表示UA 或OA 的摩尔质量，me表示乙醇的质量，Me表示乙醇的摩尔质量，ms表示离子液体的质量，Ms表示离子液体的摩尔质量。

1.3.3 UA 和OA 的结晶分离 利用冷却结晶初步探讨了结晶分离UA和OA的实验条件。

（1）向250 ml 圆底烧瓶中加入一定浓度的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液。

（2）UA 和OA 按照合适的投料比分别加入圆底烧瓶，置于50℃水浴锅中，搅拌。

（3）当烧瓶中的UA 和OA 刚好完全溶解时，立即取出并置于一定温度的水浴中冷却结晶一段时间。

（4）过滤，收集结晶，并放在60℃的烘箱中烘干；用HPLC测定晶体的纯度。

2 实验结果与讨论

2.1 UA 和OA 在不同离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度数据

由于所选离子液体的黏度很大，测定溶解度时操作困难，故以乙醇为稀释剂降低其黏度，同时也可降低该分离方法的成本。表1、表2及图3、图4列出了UA 和OA 在6 种5%的离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度数据。与文献[20-22]比较，加入离子液体后，UA 和OA 的溶解度有一定的提高，这是因为离子液体具有类似表面活性剂的增溶效果；另外，UA 和OA 中的羟基和羧基可与离子液体形成较强的氢键，从而增加它们在离子液体体系中的溶解度[24-25]。如图3 和图4 所示，UA 和OA 在六种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度均随着温度的上升而增大，且在5%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液中UA和OA溶解度差异较大。

2.2 溶解度数据的拟合

分别用Apelblat 方程、van’t Hoff 方程、三次多项式模型对UA 和OA 在六种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度数据进行了拟合，并通过均方根偏差（RMSD）和相对平均偏差（RAD）评价了模型的适用性，RMSD 和RAD 值越小，说明溶解度数据拟合得越好[26]。

RMSD 和RAD 计算公式分别如式（2）和式（3）所示。

式中,n 表示实验测量的溶解度数据点；xi

图3 UA溶解度数据及Apelblat拟合曲线Fig.3 Mole fraction solubility of UA and correlated by Apelblat model

表1 UA在6种离子液体+乙醇的混合溶液中的溶解度Table 1 Solubility of UA in the six mixed solutions of ionic liquids+ethanol

表2 OA在6种离子液体+乙醇的混合溶液中的溶解度Table 2 Solubility of OA in the six mixed solutions of ionic liquids+ethanol

c表示通过各种拟合方程计算得到的UA 和OA 摩尔分数；xi是实验测得的UA和OA的摩尔分数。

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2.2.1 Apelblat 方程拟合 Apelblat 三参数方程模型[式(4)]是假设溶解度的热焓随温度线性变化，再由Clausius-Clapeyron 方程推出溶解度随温度变化的关系[27-33]。UA 和OA 溶解度的Apelblat 模型拟合曲线分别如图3 和图4 所示，相关拟合参数列于表3和表4中。

式中，x 表示UA 或OA 在6 种离子液体+乙醇混合溶液中的摩尔分数；T 表示温度，K；a、b、c 表示的是模型的三个不同的参数。

图4 OA溶解度数据及Apelblat拟合曲线Fig.4 Mole fraction solubility of OA and correlated by Apelblat model

表3 拟合UA溶解度数据的Apelblat模型参数Table 3 Parameters of Apelblat model for UA solubility data

表4 拟合OA溶解度数据的Apelblat模型参数Table 4 Parameters of Apelblat model for OA solubility data

2.2.2 van’t Hoff 方程拟合 在温度变化范围不大时，溶质的溶解度与温度也可用简化的van’t Hoff模型[式(5)]表示[27-33]。

式中，d和e是van’t Hoff模型的参数。

UA 和OA 溶解度的van’t Hoff 模型拟合曲线分别如图5 和图6 所示，相关拟合参数列于表5 和表6中。

2.2.3 多项式经验方程 多项式经验方程在关联溶解度数据时，假设在溶剂、溶质和压强等因素确定情况下，溶解度只是随着温度的变化而变化[33-34]，本文利用三次多项式[式（6）]对UA 和OA 的溶解度数据进行了拟合。

图5 UA溶解度数据及van’t Hoff拟合曲线Fig.5 Mole fraction solubility of UA and correlated by van’t Hoff model

表5 拟合UA溶解度数据的van’t Hoff模型参数Table 5 Parameters of van’t Hoff model for UA solubility data

表6 拟合OA溶解度数据的van’t Hoff模型参数Table 6 Parameters of van’t Hoff model for OA solubility data

UA 和OA 溶解度的三次多项式模型拟合曲线分别如图7、图8 所示，相关拟合参数列于表7 和表8中。

表7 拟合UA溶解度数据的三次多项式模型参数Table 7 Parameters of cubic polynomial model for UA solubility data

对比表3～表8 可知：三次多项式模型的RAD 和RMSD 值比Apelblat 方程和van’t Hoff 方程的都要小，所以三次多项式方程能更好地关联OA 与UA 在六种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度数据。

2.3 结晶分离UA与OA的单因素实验

溶解度测定实验发现，在5%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液中UA 和OA 溶解度差异较大，故选择以1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液为结晶溶剂，通过单因素优化法，对结晶分离工艺进行了初步优化。探讨了离子液体浓度、原料中UA/OA 质量比、结晶温度、结晶时间对OA在结晶产品中含量的影响。

图6 OA溶解度数据及van’t Hoff拟合曲线Fig.6 Mole fraction solubility of OA and correlated by van’t Hoff model

表8 拟合OA溶解度数据的三次多项式模型参数Table 8 Parameters of cubic polynomial model for OA solubility data

首先，考察离子液体浓度对产品中OA 含量（wOA）的影响，分别用1%、3%、5%、7%、9%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液对UA 和OA 进行结晶分离，UA 与OA 质量比、结晶温度、结晶时间分别为1∶1、35℃、14 h，由图9（a）可知，随着1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸浓度的增大，OA 质量分数先增大后逐渐减小，因此利用5%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇溶液结晶分离UA 和OA 效果较好。

其次，考察原料中UA 与OA 的质量比对产品中OA 含量（wOA）的影响，取UA 与OA 的质量比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1 的混合物分别进行结晶分离研究，离子液体浓度、结晶时间、结晶温度分别为5%、35℃、14 h，由图9（b）可知，在实验条件范围内，原料中UA 与OA 质量比对结果影响较小，UA 与OA质量比为1.5∶1时，产品纯度稍高。

然后，考察结晶温度对产品中OA 含量（wOA）的影响，当离子液体浓度、UA 与OA 的质量比、结晶时间分别为5%、1.5∶1、14 h，在五个不同温度（20、25、30、35、40℃）下分别进行结晶分离实验，由图9（c）可知，随着结晶温度的上升，OA 含量缓慢增大；但结晶温度超过30℃时，OA 含量大幅度下降；因此结晶温度设置为30℃较好。

图7 UA溶解度数据及三次多项式拟合曲线Fig.7 Mole fraction solubility of UA and correlated by cubic polynomial model

最后，考察结晶时间对产品中OA 含量（wOA）的影响，将离子液体浓度、UA 和OA 质量比、结晶温度固定为5%、1.5∶1、30℃，结晶时间分别为6、10、14、18、22 h，由图9（d）可知，随结晶时间的延长，结晶产物中OA 的质量分数先增大后减小，当结晶时间为14 h时，OA含量较高。

综上所述，在5%1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶剂中，当原料中UA 和OA 质量比为1.5∶1，结晶温度30℃和结晶时间14 h，结晶产物中OA的质量分数可达到85%。

与文献中模拟移动床[8]或色谱法[9]分离UA 和OA 相比较，本方法更为简便，更易于放大。当然，要特别注意离子液体回收利用的问题[35]。结晶母液经过套用后，可采用两种较简便的办法回收离子液体：其一，先回收结晶母液中的乙醇，再加入另一与离子液体不互溶的溶剂萃取出UA 和OA，离子液体就可实现回用；其二，先回收结晶母液中的乙醇，再加入与离子液体可互溶的溶剂，但该溶剂可明显降低UA 和OA 的溶解度，使UA 和OA 析出，过滤后就可回收离子液体。

3 结 论

本实验测定了UA 和OA 在离子液体+乙醇混合溶剂体系的溶解度，并对其结晶分离工艺进行了初步探讨研究，得出如下结论。

（1）在293.2～333.2 K 范围内，UA 与OA 在六种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度均随着温度的上升而增大，其中，在5%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液中UA 与OA 溶解度差异较大。

（2）溶解度数据分别用Apelblat 方程、van’t Hoff 方程和三次多项式模型进行了拟合，结果发现三次多项式方程能更好地关联UA和OA在6种离子液体+乙醇混合溶液中的溶解度数据。

图8 OA溶解度数据及三次多项式拟合曲线Fig.8 Mole fraction solubility of OA and correlated by cubic polynomial model

（3）利用5%的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸+乙醇混合溶液对UA 和OA 进行了结晶分离，通过单因素实验对结晶工艺条件进行了初步优化，得到较佳的工艺条件：结晶温度30℃，结晶时间14 h，1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸的浓度5%，UA 和OA 质量比1.5∶1，在此条件下结晶产物中OA 的质量分数可达到85%。

图9 结晶实验条件对产品中OA含量的影响
Fig.9 The effect of experiment conditions on the mass fraction of OA in the product

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