硝化细菌工业化快速富集

刘宗跃，杨宏，王少伦，王佳伟

（北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室，北京100124）

引 言

硝化细菌大多数属于好氧自养型，相比于反硝化细菌等异氧菌，其世代时间长、增殖速率慢，易受到温度、溶解氧（DO）、pH、毒性物质的影响[1-2]。硝化细菌的这些特性会直接影响到氨氮废水处理出水的稳定性。提高硝化细菌浓度来强化处理效果是一种有效途径。通过包埋固定化技术将特定的功能菌群固定起来，能真正实现污水处理有效功能菌相对较高浓度的存在[3]，从而可解决活性污泥法单泥系统中各菌群相互制约、相互影响，导致各功能菌群不能充分发挥最佳生化性能的问题。同时针对不同的污水类型包埋固定化可以实现定性定量的投加[4]。因此，快速有效地筛选、驯化出性能优良的硝化细菌种群是通过包埋技术实现生物脱氮的有效途径。

现阶段，国内外有关硝化细菌中试规模的研究，常见的是采用活性污泥富集硝化污泥。冬季污水厂出水总氮浓度达标困难，被富集的硝化细菌直接接种到主流工艺后硝化能力会提高，氮的去除效率也会随之提高[5]。但随着后期运行时间的推移，富集的硝化细菌难以在系统中稳定存在，需要不断地补加污泥。通过富集培养后高效的硝化细菌作为包埋固定化的菌源，对含氮污废水实现定量投加，不仅能增加硝化细菌的浓度而且能稳定存在，并且较少地产生剩余污泥[6]。

本实验通过工业级生物反应器探究快速培养硝化细菌的技术途径，为包埋固定化技术提供高效、稳定的硝化细菌菌源。

1 材料与方法

1.1 污泥富集培养材料与方法

本实验采用大型的工业级生物反应器，通过PCL 控制实验参数（pH、DO、温度）进行硝化细菌富集培养探究。

营养物质采用实验室人工配制原液。由于反应器有效容积过大，原药箱配制高氨氮溶液，初始氨氮浓度为50 mg·L-1。组分组成（高浓度氨氮按倍数增加）及常量元素质量浓度：NH4Cl 156.5 mg·L-1，NH4H2PO442.64 mg·L-1，MgSO4·7H2O 20 mg·L-1，CaCl210 mg·L-1。pH 用Na2CO3溶液调节，每1 L 水中加入100 g Na2CO3，即碱水浓度100 g Na2CO3·L-1。

微量元素组分组成：ZnSO4·7H2O 0.12 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.12 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.15 mg·L-1，FeCl3·6H2O 1.5 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.03 mg·L-1，NiCl2·6H2O 0.12 mg·L-1，Mn2SO4·H2O 0.12 mg·L-1。每1 L药箱原水加入1 ml的微量元素。

1.2 实验装置、运行工况与培养方式

1.2.1 实验装置 污泥富集装置示意图见图1。实验原始污泥取自实验室原有经过驯化的硝化污泥（由高碑店污水厂A2O 回流活性污泥驯化），该污泥闲置20余天但仍具有硝化活性。

图1 污泥富集装置示意图Fig.1 Schematic diagram of sludge enrichment device

1.2.2 运行工况 反应器总容积为3000 L，有效容积控制在2500 L。培养分三个阶段进行，各阶段工况参数见表1。

表1 各阶段运行工况Table 1 Operation conditions of each stage

1.2.3 培养方式 整个培养过程采用氨氮流加-间歇式运行[7]，分为反应、沉淀、排水、进水。反应阶段氨氮流加进药、碱箱自动加碱。为了控制反应器有效体积2500 L 左右和FNA(游离亚硝酸盐)不至于抑制AOB（氨氧化细菌）、NOB（亚硝酸盐氧化细菌），需要定期排水，排水周期根据不同氨氧化效率下产生FNA 值进行调整。排水过程中通过加清水再排水程序对污泥进行清洗。适当排除部分污泥以淘洗非目标菌群而筛选AOB 菌群，以及适当控制AOB污泥龄[7]。

（1）反应：氨氮流加、PCL 自控柜控制计量泵自动加碱、溶解氧通过阀门控制气量。

（2）沉淀：沉淀时间30 min（为保证硝化污泥充分沉淀，防止硝化细菌被排出）。

（3）排水：将沉淀上清液经高位排水管排出反应器，容积排至500 L左右。排水时间30 min。

（4）进水：排水完成后将水加至没过探头（pH、DO、温度），此时反应器体积为1500 L，温度通过发酵罐的加热水套水浴加热到25℃后开始运行。

1.3 分析项目及检测方法

采用Illumina HiSeq2500PE250高通量测序平台对样品进行测序。包括DNA 提取与PCR 扩增，DNA文库定量、测序和生物多样性分析[9]。

2 结果与讨论

2.1 硝化细菌富集结果分析

图2中进水氨氮浓度为药箱平均每小时进入反应器中的氨氮浓度（经过体积折算）。由图2可以看出，在A阶段初期硝态氮生成比例较高，亚硝态氮积累率较低。随着后期培养时间的增加，亚硝态氮生成比例逐渐变高。在B阶段硝态氮生成量开始出现下降，亚硝态氮生成量随着进水氨氮浓度的升高而逐渐升高，在B 阶段末期亚硝态氮积累率处于一个较高的水平上。C 阶段处于规律排泥阶段，硝态氮生成量处于一个较稳定的状态。从整个培养时期来看，运行阶段的出水氨氮控制在30 mg·L-1以下，进水负荷的浓度根据氨氧化效率的变化而改变。硝态氮生成量呈现一个先增加后下降趋势，亚硝态氮生成量不断上升。推测原因：随着氨氧化效率的升高，反应器体系里亚硝态氮的积累量逐渐增多，反应周期结束排水时平均亚硝态氮浓度达1500 mg·L-1，对应FNA 为0.031[10]，该浓度下FNA 已经对NOB 产生抑制作用。B 阶段末期通过排泥，可以有效控制AOB与NOB之间污泥龄的差异。

图2 各阶段进出水NH4+-N和NO2--N、NO3--N生成量变化曲线Fig.2 Change curve of NH4+-N,NO2--N and NO3--N production in the inflow and outflow water of each stage

在图3 中可以看出在A 阶段末第24 天，污泥浓度为3000 mg·L-1左右时，污泥增长速率最快，与其相对应的氨氧化速率也呈现较快的增长。进入B、C阶段后污泥增长速度较A 阶段开始减缓，而B 阶段末期第60 天开始取泥。在开始取泥后的几天发现氨氧化速率有较高的增长，说明适度排泥可以实现AOB的进一步筛选。在第130天污泥浓度重新降低至2820 mg·L-1。观察其污泥浓度又呈现较高速率的增长，可以验证在A 阶段末期（第24 天）为污泥快速增长期。当反应器中污泥浓度较高时，由于其基数大，单位时间产生新鲜污泥的量就越多，但用药量也就越多。综合考虑污泥增速和培养成本，选择污泥浓度为3000～4000 mg·L-1作为最佳细菌增长控制浓度。其稳定运行阶段每天产出干泥量为0.3 kg·(m3·d)-1，湿泥（含水率85%）为2 kg·(m3·d)-1。

图3 氨氧化速率及污泥浓度增长曲线Fig.3 Ammonia oxidation efficiency and sludge concentration growth curve

对0～60 d 污泥浓度（取对数值）与培养时间作图发现其近似符合单种群增长的“S”形曲线。硝化细菌最大增殖速率与自养型细菌增殖动力学有关。由于影响菌群增长的因素众多,而且它们对增长过程的影响也不同步,所以菌群细胞特征为一随时间而变化的多元函数, 是一个不断变化的动态体系，由于菌群组成的异质性,动力学过程的分析也远较化学反应系统复杂[11-14]。logistic 方程、Monod 方程以及Michaelis-Menten 方程都可用于描述“S”形增长过程[15]，其中μmax（最大比增长速率）是最关键的一个参数。它比半饱和常数KNH对于废水的浓度更敏感,而且它能决定防止出现硝化菌流失的最短污泥停留时间[16-17]。温度、溶解氧、起始污泥浓度、体系中氨氮浓度以及有机物均会对自养细菌最大增长速率产生重要影响[18]。

由图4 可知，A 阶段较B、C 阶段比氨氧化速率和亚硝态氮积累率增速较快。说明从启动初期到结束24 d 内，原始污泥经历了快速筛选过程，硝化污泥在整个污泥系统中快速占据了主导地位。而B阶段随着污泥浓度的增高，经过继续培养比氨氧化速率和亚硝态氮积累率增长速度放缓。C 阶段经过不断的取泥过程，比氨氧化速率和亚硝态氮积累率呈现缓慢增长并稳定下来。通过对比B、C 阶段的培养数据发现，150 d 较60 d 的比氨氧化速率、亚硝态氮积累率同比增长率分别为9.5%、2.2%。而通过下文高通量数据发现两者高通量中AOB 占比分别为27%和52%，同比增长率为92%。说明随着培养时间的延长，污泥浓度的增加及规律的排泥虽然使得AOB 在生物群落中占比大大增加，但在氨氧化速率和亚硝态氮积累率上并没有得到快速响应。因此通过较短的时间对原始污泥进行驯化，不仅能够实现硝化细菌在生物群落中快速占据一定的比例，且培养经济性最佳。

图4 比氨氧化速率和亚硝态氮积累率变化曲线Fig.4 Change curve of specific ammonia oxidation efficiency and nitrite nitrogen accumulation rate

2.2 高通量测序结果分析

2.2.1 菌群聚类及多样性分析 L0～L3 为系统运行时第0 d、60 d、150 d、180 d 的污泥样。四组样品的16S rRNA基因文库高通量测序，污泥起始样（L0）与富集培养后的污泥样（L1、L2、L3）Alpha 多样性指标结果见表2。

表2 Alpha多样性指标计算结果Table 2 Calculation results of Alpha diversity index

经历一段时间的培养筛选，从ACE 指数下降可以看出污泥系统中微生物种群的丰度大幅度下降。Shannon 指数由最初的3.44 降至2.54，Simpson 指数由最初的0.12 上升至0.30，说明经过定性筛选适应环境的硝化细菌大量增殖，菌群的多样性和均匀性在降低。功能菌群在系统中逐步占据主导地位并且稳定下来。Wittebolle 等[19]指出微生物种群的均匀性越高，该系统在应对环境冲击时的功能稳定性越好。但因包埋固定化技术可以实现对菌群的良好保护，因此即使在功能菌群占比高、整体菌群均匀性低的情况下仍能应对复杂水质及冲击负荷。而且能够充分发挥优势功能菌群的作用，维持系统稳定性[20]。

2.2.2 硝化功能菌群变化分析 图5～图8 分别对应L0～L3 属层次污泥样本丰度饼图。L0 样品中未分类菌种占比高达80.11%，推测原因可能是污泥经过一个较长时间放置长期处于缺氧厌氧状态使得其中的杂菌滋生。 具有硝化作用的菌属Nitrosomonas 仅占7.75%，NOB 未检出。其他菌属多以反硝化功能的兼性厌氧菌、芽单孢杆菌属和其他杂菌构成。经历A、B 两个阶段的培养L1 样本高通量显示，亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)已变成反应器体系中第一大优势菌种占比27.7%，硝化杆菌（Nitrobacter）占比2.67%。

图5 原始污泥的种群分布Fig.5 Population distribution of original sludge

图6 60 d的种群分布Fig.6 Population distribution in 60 days

图7 150 d的种群分布Fig.7 Population distribution in 150 days

图8 180 d的种群分布Fig.8 Population distribution in 180 days

C 的阶段末期和后期运行对应的L2、L3 样本显示，亚硝化单胞菌属Nitrosomonas(AOB)占比分别是52.33%、56.59%。硝化杆菌属Nitrobacter（NOB）占比分别是1.15%、0.67%。通过继续培养并不断产泥过程，发现AOB 不仅能占据主导地位并且占比逐步变高。分析有以下原因：（1）后期pH 维持着较高的水平8.0以上（普遍认为AOB比NOB适宜生长pH条件较高，适宜AOB生长的pH范围为7.0～8.5，NOB为6.0～7.5[21-22]）。（2）随着后期污泥浓度增大，氨氧化速率变高，虽然排水周期缩短，但水中亚硝酸盐浓度积累过高，FNA 对NOB 逐渐产生了抑制（游离亚硝酸完全抑制NOB 和AOB 生长的浓度分别为0.02 mg·L-1和0.4 mg·L-1[23-25]，反应器排水时平均亚硝酸盐浓度1500 mg·L-1，此时FNA=0.031 大于0.02[26]）。（3）排泥的过程就是AOB 筛选的过程。由于氨氧化细菌（AOB）较硝化细菌（NOB）世代时间短[27]、繁殖速率快，所以规律快速的排泥使细菌得到了筛选。

通过对比三个阶段的高通量和数据分析发现，随着培养继续污泥浓度的增加及规律的排泥在硝化效率和积累率上并没有得到快速响应。从实际培养效果来看，一方面一味地提升AOB 的占比使其成为菌群结构中绝对优势菌属并不能相应地带来较好的比氨氧化速率。这可能与菌群之间的协同、共生作用有关。有研究表明污水生物处理工艺(包括硝化工艺)作为多物种共存的复杂生态系统，其所表现出的系统功能不仅受特定功能菌群的影响，还与共存的其他物种有关[28-29]。另一方面反复的筛选需要较长的培养时间和较大的经济成本。

2.2.3 微生物种群结构变化 选取污水厂2个活性污泥样分别命名为H1、H2，图9中分别从门、纲和属水平分析了活性污泥与各培养阶段的硝化污泥微生物种群结构变化。6 个样本中相对丰度大于1%的菌门类共检测到13 个，其中变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为各个样本的主要优势菌门。尽管从门种类上来看各样本种群组成基本相同，但从单个门类的相对丰度和构成来看存在明显的差异。L0 中拟杆菌门为其第一大类优势菌门，相比其他样品其占比高达49.95%。观察其对应的纲水平下发现鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)为主要贡献者。研究表明，Sphingobacteria 作为一种能够产生鞘脂的细菌，包括聚糖菌等细菌[30]。正由于其特殊的鞘脂结构和体内富集的PHA 等高能物质的存在，其对于饥饿环境有着较强的抵抗能力，故而可以在长期饥饿环境中得以生存。H1、H2 作为平行样，无论从门、纲和属上物种相对丰度差别不大。而各个样本从门、纲种类上种群组成相同可印证它们之间的同源性。后期培养过程中由于定向筛选的原因而导致种群丰度上的明显差异，这一点从各个样本属层次的差异性更能看出。经过24 d 培养L1 样本与L0相比，拟杆菌门（Bacteroidetes）有大幅度下降。表现在纲水平分别是鞘脂杆菌纲(Sphingobactera)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、黄杆菌纲(Flavobacteria)等异养菌的大量减少。说明经历短暂的好氧底物投加即可以实现对异养菌的快速淘洗。与初期L0样本相比，L2、L3 样本在变形菌门（Proteobacteria）和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)水平上分别有平均30%、37%增长。 这主要由属水平上亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）增长的结果导致。从整个培养时期的种群结构变化发现，通过工业级生物反应器定性短期筛选可以实现特定菌门、特定菌属的优势富集。

图9 污泥样本中含量大于1%的细菌序列的相对丰度（门、纲和属水平）Fig.9 Relative abundance of bacterial sequences(at the level of phylum,class and genus)containing more than 1%in sludge samples

3 结 论

（1）通过工业级反应器富集培养硝化细菌数据结果发现，在起始阶段末期24～27 d，污泥浓度3000～4000 mg·L-1左右时污泥增长速率最快、产泥经济性最佳。其稳定运行阶段每天产出干泥量为0.3 kg·(m3·d)-1，湿泥（含水率85%）为2 kg·(m3·d)-1。

（2）从整个培养过程中的高通量在不同水平上的变化可以说明通过生物反应器定性短期筛选可以实现特定菌门、特定菌属的优势富集，并且以较短时间即可实现功能菌筛选及产出。

（3）证明了该生物反应器对硝化细菌规模化快速富集培养并稳定产泥方法的可行性。为包埋固定化技术实现规模化应用在菌源制备方面提供了技术路线。通过硝化细菌培养实验探究，优化了培养周期，解析了菌群演变规律。