靶向于Galectin-10蛋白的哮喘抑制剂设计

时间：2024-09-03

李南星，张麟

（天津大学化工学院，天津 300350）

引言

哮喘是一种慢性支气管疾病[1]。其发生是由于先天和适应性免疫系统细胞与上皮细胞共同作用，导致支气管超反应性(哮喘患者平滑肌细胞对冷空气和运动等非特异性刺激的反应趋势)、黏液分泌过多、气道壁重塑和气道狭窄[2]。在易感患者中，会反复出现呼吸短促、喘息和胸闷等症状[1,3]。目前全球哮喘患者约有3亿[1-2,4]，每年有25万～35万人死于哮喘[5-6]，导致对哮喘疾病的大量医疗支出。该病在发达国家成人中的发病率约为10%[3]。哮喘疾病已经对世界经济和社会发展造成极大负面影响，是人类社会面临的一个健康难题和挑战。

嗜酸性粒细胞炎症是哮喘中主要的炎症类型，由其导致的哮喘约占全部严重哮喘的40%～60%[6-8]。1853 年，Charcot 报道了哮喘患者气道中的细胞外双锥体晶体，Leyden 在1872 年也有类似报道[9]，该晶体后被命名为Charcot-Leyden 晶体(CLCs)。在慢性鼻窦炎、寄生虫感染和伴有组织嗜酸性粒细胞的癌症中也观察到类似的晶体[10-11]。CLCs是嗜酸性粒细胞死亡的一个标志，可以在组织中存活数月。CLCs 由人类嗜酸性细胞中最丰富的蛋白质之一Galectin-10(Gal10)组成[12]。Gal10 从活化的嗜酸性粒细胞的细胞质中被释放出来，经历相变成为晶体进而引发哮喘疾病。已有研究表明，使用Gal10晶体诱导动物免疫反应可以产生抗体，抗体可以快速溶解患者黏液中大量存在的CLCs，在临床前模型中解决CLC 晶体病变的关键特征，研究认为抗体结合在Gal10 晶体的关键表位Y69 处介导晶体堆积作用导致晶体溶解，定点突变Gal10 蛋白的Y69 确可使得Gal10蛋白不再结晶[13]。

目前临床上治疗哮喘大多基于疾病严重程度使用经验方法，而不是基于潜在的发病机制。通常使用扩张支气管和抗炎抗过敏药物[14-16]来缓解症状。单克隆抗体药物[17-20]虽然靶向于一些致病靶点，但其治疗成本非常高。因此，针对嗜酸性粒细胞性炎症哮喘，解析Gal10 蛋白结晶或溶解中涉及的关键作用位点和相互作用分子细节，由此设计多肽抑制剂以抑制哮喘，具有重要研究意义。

本课题组前期已经基于蛋白质表界面研究[21]，设计开发靶向于胶原蛋白的血栓抑制剂[22-26]、病毒样颗粒配基[27-28]、埃博拉病毒中和配体[29]等。本文沿用蛋白质表界面分析流程，利用分子动力学模拟和结合自由能分析方法确定Gal10 蛋白与抗体结合作用的关键位点和相互作用分子细节，通过构建亲和模型、建立多肽抑制剂库以筛选确定高效的哮喘抑制剂。

1 实验模型和方法

1.1 模型

哮喘溶晶抗体1D11 与Gal10 蛋白结合的晶体结构来源于Protein Data Bank(PDB ID 6GLW，http://www.rcsb.org/pdb/)[13]，采用GROMOS96 43a1力场。模拟环境为生理盐水溶液并通过反离子平衡系统净电荷，其中水分子采用SPC/E 模型。模拟体系的盒子尺寸为13 nm×13 nm×9 nm，包含46989 个水分子、137个钠离子和139个氯离子。

1.2 分子动力学模拟

采用GROMACS 5.1.4[30](http://www.gromacs.org/)进行50 ns 正则(NVT)系综分子动力学(molecular dynamics，MD)模拟。系统温度通过velocity-rescale(v-rescale)[31]方法维持在310.15 K。使用LINCS[32](Linear Constraint Solver)算法限制共价键和键角的震动。使用三维周期性边界条件。静电相互作用通过PME[33](Particle-mesh Ewald)算法处理。相邻原子截断距离、库仑截断距离以及LJ(Lennard-Jones)势能截断距离都设定为1.2 nm。粒子初始速度根据310.15 K 温度下的Maxwell 分布获得。模拟采用Verlet 算法，积分步长设定为2 fs。各体系于模拟开始前都经历能量最小化。模拟过程至少重复三次。

1.3 结合自由能分析

通过分子力学-泊松-玻尔兹曼方程-表面积(MM-PBSA)[34]自由能分析方法和g_mmpbsa[35]程序解析溶晶抗体1D11与Gal10蛋白的结合自由能(ΔGbind)以及结合界面的关键氨基酸位点。结合自由能根据如下方程进行计算，从每次模拟的50 ns轨迹中以100 ps为间隔提取500个轨迹进行分析。

式中，ΔGbind是结合自由能；ΔGpolar是极性自由能；ΔGnonpolar是非极性自由能；ΔGelec是静电相互自由能；ΔGPB是静电溶剂化效应产生的自由能；ΔGvdW是范德华相互自由能；ΔGSASA是非极性溶剂化效应产生的自由能。

1.4 多肽抑制剂的亲和模型及肽库构建

基于MM-PBSA 自由能解析获得的溶晶抗体1D11中与Gal10蛋白结合关键位点信息构建亲和模型，结合空间方位确定抑制剂序列，利用自编脚本生成多肽抑制剂库。

1.5 多肽抑制剂的分子对接筛选

利用分子对接、多肽抑制剂构象分析进行抑制剂筛选。分子对接以Gal10 蛋白作为受体，多肽抑制剂作为配体，采用AUTODOCK VINA 1.1.2[36](http://vina.scripps.edu/)进行分子对接。通过打分(EVINA)评估结合作用，根据打分分布情况选择多肽抑制剂进行后续筛选。

利用GROMACS 程序计算多肽抑制剂与溶晶抗体1D11 中关键残基间的均方根偏差(root-meansquare deviation，RMSD)。筛选RMSD≤0.5 nm 的多肽抑制剂进行后续筛选。

1.6 多肽抑制剂与Gal10 蛋白作用的分子动力学模拟

在通过对接结构分析评估多肽抑制剂与Gal10蛋白间结合结构基础上，利用MD 模拟研究结合的动态过程及其微观相互作用。MD模拟设置同1.2节所述。使用editconf 命令将多肽抑制剂与Gal10 蛋白的最小距离调整为1.5 nm，并选择未调整距离的结合复合物作为对照，分别为Sep体系和Com体系。

1.7 多肽抑制剂抑制效果验证

通过Gal10蛋白-溶晶抗体-多肽抑制剂三元体系的MD 模拟，研究多肽抑制剂与溶晶抗体1D11 同时存在情况下抑制剂与Gal10 蛋白的结合情况，以评估多肽抑制剂的抑制效果。采用NVT 系综模拟，计算RMSD 和回转半径(radius of gyration,Rg)评估分子构象变化，计算分子间最小距离dmin、质心距离dcom、LJ 势能(ELJ)、Coulomb 势能(EC)评估分子间结合过程。

2 实验结果与讨论

2.1 蛋白复合物的分子行为

通过50 ns MD 模拟考察Gal10 蛋白与溶晶抗体1D11 在生理盐水中的分子行为，如图1 所示。结果显示，模拟过程中蛋白与抗体间的最小距离dmin基本保持在0.17 nm，表明复合物的结构稳定。Coulomb势能和LJ势能为负值，表明静电作用和疏水相互作用驱动蛋白与抗体间结合。相对于溶晶抗体，Gal10蛋白的RMSD 值更小，表明Gal10 蛋白分子结构较稳定而溶晶抗体结构相对易变。蛋白与抗体的Rg值随模拟变化都较小，表明二者结构紧密。

图1 Gal10蛋白与溶晶抗体1D11间相互作用分析Fig.1 Molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.2 结合自由能解析

通过MM-PBSA 自由能分解计算溶晶抗体1D11与Gal10 蛋白的结合自由能。ΔGelec=-231 kcal·mol-1（1 cal=4.18 J），ΔGvdW=-75 kcal·mol-1，ΔGSASA=-7 kcal·mol-1，表明静电相互作用、范德华相互作用及非极性溶剂化效应均对结合起有利作用。ΔGPB=247 kcal·mol-1，表明静电溶剂化效应对结合起不利作用。根据1.3节所述自由能计算方程，ΔGpolar=16 kcal·mol-1，ΔGnonpolar=-82 kcal·mol-1，最终结合自由能ΔGbind=-66 kcal·mol-1，表明疏水相互作用促进结合，考虑溶剂效应后静电相互作用对结合不利，因而二者结合主要由疏水相互作用驱动。

计算结合界面上各氨基酸残基的结合自由能，如图2 所示。确定Gal10 蛋白的Y69、K117、D113、E68、I116、H114，溶晶抗体1D11 的W53-H、Y104-H、N97-L、K55-L、Y93-L、R100-H 对结合比较有利，其中W53-H为疏水氨基酸残基。对结合不利的主要为带电氨基酸残基，如Gal10 蛋白中的K73、R115、E119 及溶晶抗体1D11 中的E52-L、D99-H。综合前述结合自由能分析，确认疏水作用是Gal10蛋白和溶晶抗体1D11结合的主要驱动力，同时也证实Y69 在蛋白与抗体结合过程确有关键作用，与文献报道[13]结果相符。

图2 Gal10蛋白与溶晶抗体1D11的相互作用界面分析Fig.2 Molecular interface between Gal10 protein and antibody 1D11

2.3 亲和模型的构建与多肽抑制剂库的建立

以溶晶抗体1D11 关键作用位点为基础构建亲和模型并建立多肽抑制剂库，综合考虑位点距离和自由能贡献大小，选取W53-H、Y104-H、N97-L、Y93-L 构建亲和模型，如图3 所示。结合空间方位设计得到多肽抑制剂特征序列WXYXXNXY(其中X代表20 种常见氨基酸的任意一种)。利用自编脚本生成多肽抑制剂库，保证抑制剂库内的序列多样性及构象多样性。

图3 基于Gal10蛋白与溶晶抗体1D11相互作用的抑制剂设计Fig.3 Design of inhibitors based on the molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.4 多肽抑制剂的分子模拟筛选

利用AUTODOCK VINA 将多肽抑制剂与Gal10蛋白依次进行对接。对接结果显示多肽抑制剂结合打分(EVINA)分布在-8.3～-3.6 kcal/mol 范围内，表明所有多肽抑制剂都能与Gal10 蛋白自发结合，但由于多肽抑制剂序列和构象的差异而表现出对Gal10蛋白不同的亲和力。根据多肽抑制剂结合打分分布情况，综合考虑后续筛选步骤，确定以结合自由能≤-7.5 kcal/mol 为标准，获得209 个多肽抑制剂进行后续筛选。

利用GROMACS 程序计算多肽抑制剂与溶晶抗体1D11 关键残基间的RMSD 值，以确定二者结构相似性，即考察抑制剂模拟溶晶抗体1D11 关键位点的效果。结果显示，RMSD 值分布在0.3～1 nm范围内。以RMSD≤0.5nm 为标准，获得17 个多肽抑制剂进行后续筛选。利用VMD 软件进行构象比对和结合位点分析，结果最好的10 个多肽抑制剂如图4所示。

图4 溶晶抗体1D11关键残基与多肽抑制剂的构象比对Fig.4 Conformational comparison between the key residues of the antibody 1D11 and polypeptide inhibitors

2.5 多肽抑制剂与Gal10的分子动力学模拟

结合对接结果EVINA、结构相似性分析RMSD 及构象比对结果，选取6个多肽抑制剂进行后续MD模拟验证，具体信息如表1所示。

表1 抑制剂筛选结果Table 1 Results of inhibitor screening

多肽抑制剂与Gal10 蛋白的结合情况如图5 所示。在生理盐水环境下，Sep 体系中人为分开的WGYGWNGY和Gal10蛋白间，最小距离经历3 ns左右的波动后达到稳定波动，质心距离逐渐变小并在4 ns左右达到稳定波动，表明抑制剂能够和Gal10蛋白结合迅速且稳定。Sep 体系中的WGYGWNGY 的RMSD 值略大于Com 体系，表明结合过程中抑制剂存在结构变化。能量分析显示，Gal10 蛋白和WGYGWNGY 间的Coulomb 势能和LJ 势能从2 ns 左右开始减小，且随着多肽抑制剂结构逐步稳定，Coulomb 势能和LJ 势能的变化也趋于稳定，能量变化趋势和大小与Com 体系基本一致，确证其稳定结合。轨迹中截取构象表明WGYGWNGY 结合在Gal10蛋白的关键位点附近。

图5 Gal10蛋白与WGYGWNGY相互作用情况Fig.5 Molecular interactions between Gal10 protein and WGYGWNGY

2.6 多肽抑制剂抑制效果验证

对Gal10蛋白-溶晶抗体-多肽抑制剂三元体系进行MD 模拟，结果如图6 所示。WGYGWNGY 与Gal10蛋白间的最小距离在5 ns内降低至0.1 nm，质心距离同步降低至2 nm，后续呈现稳定波动，相互作用势能也在4 ns 左右开始降低，表明WGYGWNGY快速结合到Gal10 蛋白表面。在WGYGWNGY 与Gal10蛋白结合期间，溶晶抗体1D11逐渐远离Gal10蛋白，且相互作用势能始终为0，表明WGYGWNGY竞争性结合Gal10 蛋白，结合效果优于溶晶抗体1D11。因此，WGYGWNGY被认为是与Gal10蛋白具有高亲和力的溶晶抗体1D11仿生多肽抑制剂。

图6 Gal10蛋白、WGYGWNGY与溶晶抗体1D11相互作用情况Fig.6 Molecular interactions of Gal10 protein,WGYGWNGY and antibody 1D11