核壳结构磁性树枝状纤维形有机硅固定化脂肪酶制备及其应用

王立晖，刘焕，李赫宇，郑晓冰，3，姜艳军，3，高静

（1河北工业大学化工学院，天津 300130；2天津益倍生物科技集团有限公司，天津 300457；3化工节能过程集成与资源利用国家地方联合工程实验室，河北工业大学，天津 300130）

引言

生物酶催化技术是生物催化技术的核心之一，其反应过程温和、环境友好、催化高效，将其应用于食品、精细化学品以及其他高附加值产品的生产并逐渐替代部分传统化学方法已成为绿色化工的必然趋势[1-3]。脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)因其具有较高的化学选择性、立体选择性、区域选择性等优点，在许多工业领域得到了广泛的应用[4-5]。然而，尽管游离酶具有诸多优点，但由于其热稳定性低、重复使用困难等问题，限制了其实际应用。酶固定化技术作为提高酶稳定性和循环使用的最有效方法得到了广泛研究[6-8]。固定化酶载体的理性设计和固定化方法的开发不仅可以有效利用酶分子与载体的构效关系实现酶分子的高效固定化，而且有利于提高固定化酶的催化性能并实现从反应体系中的快速分离和重复使用[9-10]。

磁性分离作为一种简单便捷的分离方法，在反应过程控制中具有独特的操作优势，也越来越多地应用到化工、环保和医药等领域[11]。超顺磁性粒子是磁性分离技术中最为热门的研究内容，其优势主要包括：超顺磁性悬浮粒子可以实现催化剂在反应体系中的充分混合，有利于反应进行；可以通过外加磁场控制反应进程，并实现定向的分离和回收；在外加磁场消失后粒子表面不会出现剩磁，避免催化剂悬浮粒子的团聚甚至沉淀[12]。而基于超顺磁性粒子构建的磁性核壳粒子作为一种极具发展前景的多功能材料，在固定化酶方面受到越来越多的关注，如Fe3O4/介孔二氧化硅[13]、Fe3O4/聚合物[14]、Fe3O4/碳[15]、Fe3O4/MOF[16]核壳结构复合材料已成功应用于酶的固定化，并对其性能进行了详细的研究。除此之外，在近年的报道中，一种以双连续型Winsor Ⅲ体系微乳液为基础开发的新型树枝纤维状二氧化硅纳米粒子(DFSP)也得到了极大的关注[17-19]。这种材料具有较大的比表面积和孔体积、可调的孔径、易修饰的孔道表面、良好的生物相容性及稳定性等优点。将以上两种材料结合，设计一种具有超顺磁性内核和丰富表面结构的磁性SiO2纳米颗粒，并将这种新型复合粒子用于酶的固定化，保护酶分子不受恶劣条件的影响是克服工业应用中的众多限制的一种有前途的方法。

脂肪酶作为一种天然的界面酶，在结构上与标准酯酶有明显的区别。大多数脂肪酶的结构包括一个由疏水表面和亲水表面构成的多肽链[20-21]。在脂肪酶空间结构中，活性口袋“盖子”的疏水区域与活性中心周围的疏水区域相互作用，使其与反应介质隔离[22]。然而，在存在疏水结构的情况下，“盖子”将被打开，使得活性中心易于和底物接触而呈现为活性增强[23]。这种界面激活作用也已被研究者所熟知并成功实践。例如，Gao 等[24]成功合成了用于CALB 固定化的疏水SiO2。其疏水表面使固定化脂肪酶具有良好的稳定性。Kalantari 等[25]报道了增加硅基载体的表面疏水性可以提高酶的活性和稳定性。这些研究表明，疏水硅基材料固定化的脂肪酶不仅具有良好的活性，而且具有良好的pH 和热稳定性[26]。将脂肪酶的界面激活作用与上述新型磁性SiO2纳米颗粒相结合，构建具有疏水性的磁性SiO2复合材料应用于脂肪酶等界面酶固定化领域，将为制备易分离、高活性、高稳定性的固定化酶催化剂提供良好的平台。

因此，本研究将以Fe3O4微球为内核，以正硅酸乙酯(TEOS)和1,2-双(三乙氧基硅烷)乙烷(BTSE)为硅源，利用改进的Winsor Ⅲ微乳液双连续相体系制备具有超顺磁性Fe3O4内核和树枝状纤维形氧化硅外壳的核壳结构磁性有机硅纳米粒子(MMOSNs)，并将其用于固定化脂肪酶CALB，以获得固定化酶CALB@MMOSNs。研究磁性载体与酶分子之间的构效关系，固定化脂肪酶的活性、稳定性，以及疏水载体对脂肪酶性能的影响，最后将CALB@MMOSNs用于催化合成乙酰丙酸酯。

1 实验材料和方法

1.1 材料

Novozym 435 (N435，丙烯酸树脂固定化念珠菌南极脂肪酶B)和CALB 购自北京高瑞森科技有限公司。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、BTSE、4-硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)、乙二醇和乙酰丙酸(LA)均为分析纯，购自阿拉丁科技(上海)股份有限公司。TEOS、柠檬酸钠、甲醇、环己烷、月桂酸、辛醇、正月桂醇、异辛烷、三氯化铁(FeCl3)、正丁醇购自天津风船化学试剂有限公司。牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝G-250 购自碧云天生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯，购自天津大茂化学试剂厂。

1.2 核壳结构磁性介孔有机硅纳米花的制备

（1）Fe3O4的制备：在25℃下，将2.60 g FeCl3、1.20 g柠檬酸钠、80 ml乙二醇置于单口烧瓶中，在水浴锅中搅拌20 min，使溶液混合均匀后，取3.12 g 无水乙酸钠加入到混合液中，室温下反应30 min。随后，将上述混合液转移到100 ml 的聚四氟乙烯反应釜里，200℃条件下保温20 h。最后，所得样品磁性分离，用超纯水和乙醇各洗4次。

（2）核壳结构磁性介孔有机硅纳米花(MMOSNs)的制备：取200 mg Fe3O4、0.16 g CTAB、75 ml 超纯水、25 ml 无水乙醇、1 ml 浓氨水(25%)依次添加到250 ml 的三口烧瓶中。超声1 h 使Fe3O4分散均匀，35℃水浴锅中保温30 min。然后，沿烧瓶壁缓慢加入30 ml 正己烷，静置10 min，使油水双相分层。滴加500 μl 的TEOS 和BTSE(体积比=1∶1)的混合液，35℃下反应70 h。所得样品磁性分离，用超纯水和乙醇各洗4 次。取1 g MMOSNs 置于无水乙醇(200 ml)和HCl(200 μl)的混合液中，反应3 h 萃取模板，重复萃取三次。

（3）核壳结构磁性介孔无机硅纳米花(MMSNs)的制备：在250 ml 的三口烧瓶中，依次加入Fe3O4(180 mg)、CTAB(0.18 g)、超纯水(70 ml)、无水乙醇(20 ml)、浓氨水(800 μl，25%)。上述混合液超声处理1 h 后，35℃水浴锅中反应30 min。然后，沿烧瓶壁缓慢加入25 ml 正己烷，静置10 min，使油水双相分层。滴加1 ml的TEOS，35℃下反应70 h。所得样品磁性分离，用超纯水和乙醇各洗涤4 次，室温干燥。最后，550℃下煅烧5 h，去除制孔剂模板CTAB，制得MMSNs。

1.3 固定化酶制备条件的优化

（1）利用吸附方法制备固定化酶：取10 mg载体，加入1 ml 的酶液，室温下，摇床上(170 r/min)孵化一定时间，测固定化酶酶活以及蛋白负载量。

（2）吸附时间的优化：取10 mg 载体分散在1 ml的酶液中，室温下，170 r/min 的摇床上反应一定时间。测吸附时间为3、4、5、6、7 h 时上清中剩余的蛋白含量。根据吸附时间和载体的蛋白含量绘制吸附进程曲线，确定最优的吸附时间。

（3）初始酶浓度的筛选：将10 mg 载体加入不同浓度(0.21、0.43、0.85、1.7、3.4、6.8 mg/ml)的酶液，室温下，170 r/min 水浴摇床反应5 h，测定固定化酶的蛋白含量和酶活，确定最优的初始酶浓度。

1.4 固定化酶负载量和酶活性的测定

（1）固定化酶负载量的测定：采用Bradford 法[27]确定固定化酶的蛋白负载量。将5 ml 的考马斯亮蓝溶液加入到1 ml 的样品中，振荡30 s。在25℃下反应5 min，利用分光光度计，测量混合液在595 nm处的吸光值。参考牛血清蛋白(BSA)的标准曲线，计算固定化酶的蛋白负载量。

（2）水解活性的测定：利用4-硝基苯基棕榈酸酯(p-NPP，5.0 mg/ml)方法测定脂肪酶的水解活性。在3 ml 的PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)溶液中，加入200 μl 的p-NPP 和200 μl 的固定化酶悬浮液(或游离酶)，振荡30 s。在25℃下反应3 min，过滤得上清液利用分光光度计测量410 nm 处的吸光值，根据上清液中对硝基苯酚(p-NP)含量，确定固定化酶(或游离酶)的水解酶活。

水解酶活的定义：单位时间(min)释放单位产物p-NP(1 nmol)所需的酶量，定义为1U。

（3）酯化活性的测定：将固定化酶(10 mg)或游离酶、月桂酸(100 mg、0.5 mmol)、正辛醇(200 μl)加入到5 ml 的环己烷溶液中。将得到的混合液在40℃的摇床上孵化2 h。利用热乙醇法测定反应前后月桂酸的量，确定固定化酶的酯化活性。

酯化活性的定义：单位时间(h)消耗单位月桂酸(1 μmol)所需的酶量，定义为1 U。

1.5 MMOSNs和CALB@MMOSNs的表征

（1）利用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和X 射线光电子能谱(XPS)表征MMOSNs 的形貌结构和元素组成。

（2）利用N2吸附-脱附实验、傅里叶红外光谱(FT-IR)和激光共聚焦显微镜(CLSM)表征MMOSNs和CALB@MMOSNs的孔径分布、孔体积、比表面积。

（3）利用磁滞回曲线(VSM)表征Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs的饱和磁性。

1.6 固定化酶的稳定性研究

（1）pH稳定性测定：室温下，将固定化酶和游离酶分别在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=10.0)和乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=4.0)中孵化一定的时间。每隔24 h，利用p-NPP 方法测定脂肪酶残余水解活性，并计算酶活回收率，如式(1)。

（2）热稳定性测定：分别将固定化酶和游离酶在60℃环己烷中浸泡一定时间，每隔12 h，利用热乙醇法测定其残余酯化活性，并计算相对酶活，如式(2)。

（3）有机溶剂耐受性测定：取适量固定化酶和游离酶在有机溶剂(甲醇、异辛烷、正己烷、叔丁醇)中孵化3 h，利用热乙醇法测定其残余酯化活性，并计算相对酶活，如式(2)。

（4）储藏稳定性测定：室温下，分别将固定化酶和游离酶存储30 d，每隔5 d 测其剩余的酯化活性，并计算相对酶活，如式(2)。

1.7 固定化酶在LA和十二醇酯化反应中的应用

（1）乙酰丙酸酯的合成反应：以脂肪酶为催化剂，催化乙酰丙酸(LA)和醇反应生成乙酰丙酸酯，其反应机理如图1所示。

图1 LA和醇的酯化反应Fig.1 The esterification reaction of LA and alcohol

（2）测定方法：利用热乙醇法，分别测量反应前后LA的量，确定LA转化率。

（3）温度对LA 转化率的影响：在无溶剂体系中，分别加入一定量的LA 和十二醇，在不同温度下(45、50、55、60℃)反应一定的时间，利用热乙醇法，测定LA转化率，确定最优的反应温度。

（4）LA/十二醇摩尔比对LA 转化率的影响：在最优的反应温度下，加入不同摩尔比的LA/十二醇(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，反应一定的时间，测定反应前后LA的量，计算LA的转化率，确定最优的LA/十二醇摩尔比。

（5）时间对LA 转化率的影响：在最优的反应温度下，将最优摩尔比下的LA 和十二醇反应一定时间，测定不同时间(0、1、5、10、15、20、22、24 h)下LA的转化率。

1.8 固定化酶的重复使用性

分别以相同初始酶活的固定化酶和N435 为催化剂，催化LA 和十二醇的酯化反应，测定其重复使用性。具体的实验过程如下：(1)在上述最优的反应条件，进行LA 和十二醇的酯化反应，利用热乙醇法测定反应前后LA 的量，计算LA 的转化率。(2)每次反应结束后，用正己烷洗涤去除未反应的底物，投入下一循环使用。

2 实验结果与讨论

2.1 MMOSNs和CALB@MMOSNs的表征

通过SEM、TEM 表征Fe3O4和MMOSNs 纳米粒子的形貌结构。图2(a)、(b)分别为Fe3O4的SEM 和TEM 图，由图可知Fe3O4具有较好的单分散性，粒径约为150 nm。图2(c)、(d)分别为MMOSNs 的SEM 图和TEM 图。由图可知，MMOSNs 是粒径约为200 nm的球形纳米粒子，具有由Fe3O4内核(150 nm)和有机硅外壳(25 nm)构成的明显核壳结构，而且有机硅层具有明显的树枝状纤维形孔道结构，丰富的表面形貌将为后期脂肪酶的负载提供良好的场所。

图2(e)、(f)为核-壳结构磁性无机硅纳米花(MMSNs)的SEM 和TEM 图，如图所示，MMSNs 同样具有明显的核-壳结构，Fe3O4作为内核(150 nm)，在其表面包覆了介孔无机硅外壳(50 nm)，并表现出与MMOSNs类似的树枝状纤维形孔道结构。

图2 Fe3O4(a)、MMOSNs(c)和MMSNs(e)的SEM图片；Fe3O4(b)、MMOSNs(d)和MMSNs(f)的TEM图片Fig.2 SEM images of Fe3O4(a),MMOSNs(c)and MMSNs(e);TEM images of Fe3O4(b),MMOSNs(d)and MMSNs(f)

通过X 射线光电子能谱(XPS)，根据元素的结合能分析载体MMOSNs 表面元素和化学键的种类，实验结果如图3 所示。根据图3(a)可知，结合能在103、154、285 和533 eV 处的特征峰分别对应Si 2p、Si 2s、C ls 和O 1s，证明MMOSNs 表面主要有O、C、Si三种元素。如图3(b)所示，对C 1s 高分辨率的XPS谱图进行分峰处理，284.4 和285.1 eV 处的特征峰依次对应C—Si 和C—C，并且C—Si 和C—C 键均来源于有机硅源BTSE[28]。同理对Si 2p 的XPS 谱图[图3(c)]进行分峰处理，102.6和103.4 eV处的特征峰分别对应Si—C 和Si—O，其中Si—C 键同样来源于BTSE[29]。由此可以证明有机MMOSNs 载体成功制备。

图3 MMOSNs的XPS表征Fig.3 XPS characterization of the MMOSNs

利用N2吸附-脱附实验表征MMOSNs 和CALB@MMOSNs 的孔道结构，如图4(a)所示，MMOSNs具有典型的Ⅳ型吸附-脱附等温线，P/P0在0.6～0.9 范围内有H1 型回滞环，说明载体具有明显的介孔结构[30-31]。由图4(b)孔径分布图可看出MMOSNs 的孔径为6.339 nm，与CALB 分子(3 nm×4 nm×5 nm)[24]匹配良好，有利于后期酶分子的固定化。除此之外，通过BET、BJH 分析可知，MMOSNs的比表面积、孔体积依次是347.9 m2/g和0.6392 cm3/g。相比于MMOSNs 的孔体积和比表面积，CALB@MMOSNs 的孔体积(0.1080 cm3/g)和比表面积(103.7 m2/g)明显要小，这是由于酶分子被负载在表面纤维形介孔孔道中占据了一定的空间，从而间接证明CALB@MMOSNs的成功制备。

图4 MMOSNs、CALB@MMOSNs的N2吸附-脱附曲线(a)和孔径分布(b)Fig.4 Nitrogen adsorption-desorption isotherms(a)and pore size distribution profile(b)of the MMOSNs and CALB@MMOSNs

对Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs进行饱和磁性研究，由图5 可以看出，MMOSNs 的饱和磁性(38.63 emu/g)较Fe3O4(62.81 emu/g)有所降低，这是由于Fe3O4的表面包裹了一层无磁性的有机硅[32-33]。而固定化以后得到的CALB@MMOSNs 的饱和磁性(28.32 emu/g)相对于MMOSNs和Fe3O4的饱和磁性也略有降低。此外由图还可以看出三种粒子均表现出超顺磁性，有利于固定化酶在反应体系中形成悬浮液而促进反应，以及后期外加磁场的条件下实现反应控制和快速分离。

图5 Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs的磁滞回曲线（1 Oe=79.5775 A/m）Fig.5 The hysteresis loops of Fe3O4,MMOSNs and CALB@MMOSNs

通过异硫氰酸荧光素(FITC)修饰CALB 分子，得到FITC-CALB。以MMOSNs 为载体，负载FITCCALB，在激光共聚焦显微镜下表征固定化酶，如图6 所示，被标记的脂肪酶分子在一定波长的激发作用下显示绿色的荧光，从而证明酶分子被成功固定在载体MMOSNs上[30]。

图6 固定化酶激光共聚焦显微镜图片Fig.6 CLSM image of the FITC-labeled CALB@MMOSNs

2.2 CALB@MMOSNs的酶学性质

2.2.1 固定化酶条件的筛选 根据图7(a)可看出，不同CALB 初始浓度条件下载体所对应最大蛋白吸附量不同，但均能在5 h 之内基本达到平衡。在5 h条件下继续研究初始酶浓度对负载量和酶活的影响，如图7(b)所示，随着CALB 初始浓度增加，CALB@MMOSNs 的负载量也逐渐增加，但是CALB@MMOSNs 的酶活却呈现先升高再降低的趋势。当CALB 初始浓度较低时，载体表面吸附位点相对酶分子过剩，吸附平衡后负载量较少，导致固定化酶活性较低[34-35]；随着初始浓度升高，负载量逐渐达到饱和甚至过饱和，载体孔道内酯肪酶分子过多导致过于拥挤甚至发生团聚，造成有效活性位点的减少，并阻碍酶分子和底物间的传质，造成固定化酶表观活性降低[9，36]。综上所述，最优的初始酶浓度以及吸附时间分别为4.80 mg/ml 和5 h。此时，固定化酶的负载量、酶活分别是177.49 mg/g和27.39 U/mg，酶活回收率为23.19%。

图7 MMOSNs在不同酶浓度下的吸附进程曲线(a)；初始酶浓度对载体的蛋白负载量及CALB@MMOSNs酶活的影响(b)Fig.7 Adsorption process of CALB at different concentrations on the MMOSNs(a)and effect of initial lipase concentration on CALB loading and specific activity of CALB@MMOSNs(b)

2.2.2 CALB@MMOSNs稳定性的研究

（1）pH 稳定性 为了探究以疏水材料MMOSNs 为载体制备固定脂肪酶的pH 稳定性，将CALB@MMOSNs 分别于pH=4.0 和pH=10.0 的缓冲溶液中孵化一定时间，并与CALB@MMSNs(核-壳结构无机硅为载体制备的固定化酶)以及游离酶的性能进行对比，实验结果如图8 所示。由图8(a)中可知，在酸性缓冲溶液(pH=4.0)中浸泡120 h后，游离酶降低为初始酶活的12.27%，此时CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs 的活性仍可保留初始酶活的48.85%和40.00%。同理，如图8(b)所示，在碱性缓冲溶液(pH=10.0)中浸泡120 h后，游离酶降低为初始酶活的23.48%，此时CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 分别保留初始酶活的74.28%和65.00%。酶分子的催化作用得益于其活性中心的高级结构，而组成酶活性中心的氨基酸侧链存在不同的功能基团以决定对底物的结合和催化。而这些必须基团往往是良好的质子供体或受体，其解离状态容易受到环境pH的影响。相较于游离酶，CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 的pH 稳定性均有明显提高，这是由于载体表面复杂的孔道结构为酶分子提供了相对稳定的微环境。在极端的条件下，可以更好地维持酶分子的空间构象而有效保持酶活[9]。除此之外，相较于CALB@MMSNs，CALB@MMOSNs 具有更好的pH稳定性，这归功于MMOSNs 载体与脂肪酶分子之间具有较强的疏水作用力，以及表面的疏水微环境，可以使脂肪酶分子维持刚性结构并实现界面激活，充分发挥活性[29-30]。

图8 游离酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs在pH=4.0(a)和pH=10.0(b)的缓冲溶液中的稳定性Fig.8 The stabilities of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs at pH=4.0(a)and pH=10.0(b)

（2）热稳定性 由图9 可知，在60℃的环己烷溶液中浸泡60 h 后，游离酶、CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 的酶活分别降低为初始酶活的25.00%、74.07%和65.00%。这种现象主要是因为酶分子在较高温度下容易发生热变性，活性中心长时间暴露在较高温度后分子内部原有的构象发生变化，次级键(如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等)也被破坏，酶分子从原来有秩序的卷曲紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构而导致失活。但是相较于游离酶，固定化酶中的酶分子被限制在匹配良好的载体孔道结构内，孔道对酶分子空间结构的限制效应可以有效保持良好的活性构象避免因温度变化而导致的失活[37]。除此之外，CALB@MMOSNs的疏水性较强，避免了水分在载体上的聚集，表现为热稳定性优于无机载体构建的CALB@MMSNs。

图9 游离酶、CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs在60℃环己烷中的热稳定性Fig.9 Thermal stabilities of free lipase,CALB@MMOSNs and CALB@MMSNs in cyclohexane at 60℃

（3）有机溶剂耐受性 测定了游离酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs在不同有机溶剂中的耐受性，结果如图10 所示。在有机溶剂中浸泡后，CALB@MMSNs 和CALB@MMOSNs 的溶剂耐受性明显优于游离酶，分析原因主要有以下两点：(1)游离酶在有机溶剂中易团聚，阻碍了底物和酶分子间的传质，表现为酶活降低，通过将酶分子负载在载体上，可有效避免酶分子聚集，从而减小传质阻力[38]；(2)载体的树枝状纤维形表面将酶分子束缚在孔道结构内，避免在恶劣环境中酶分子高级结构的变化，从而增强CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的有机溶剂耐受性。在有机溶剂中浸泡后(除甲醇外)，固定化酶的活性提高，这是因为脂肪酶CALB分子的活性中心存在一个疏水域，与疏水性的有机溶剂中相互作用发生“界面活化”，使得CALB 达到最佳的活性构象，因此表现出超活的现象[39]。但是由于甲醇的极性较强，破坏了酶分子表面的必需水，造成酶活降低。

图10 游离酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的有机溶剂耐受性Fig.10 The effect of organic solvents on the activity of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs

（4）储存稳定性 如图11所示，CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs 在储存30 d 后酯化活性均可保留初始酶活的86.00%左右，而游离酶却降低为初始酶活的57.50%。CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs的储存稳定性明显优于游离酶，一方面因为载体孔道结构对CALB 空间构象的束缚作用，在长期储存过程中保持了其活性构象[40]；另一方面由于酶分子分散在固定化酶表面，可以有效避免使用和回收过程中的酶分子团聚导致的失活。

图11 游离酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的长时间储存稳定性Fig.11 The storage stabilities of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs

2.2.3 CALB@MMOSNs 在制备乙酰丙酸十二酯中的应用 为了探究CALB@MMOSNs 的催化性能，将其用于催化LA 和十二醇的酯化反应合成乙酰丙酸十二酯。同时，优化酯化反应条件(温度、LA/十二醇摩尔比和时间)，结果如图12所示。

图12 温度(a)、LA/十二醇摩尔比(b)和时间(c)对LA和十二醇酯化反应的影响Fig.12 Effect of temperature(a),LA/n-lauryl alcohol molar ratio(b)and time(c)on esterification reaction

首先探究了温度对LA 转化率的影响。由图12(a)可知，随着反应温度由45℃升高到50℃，LA转化率增大。主要有以下两个原因：(1)LA和十二醇为吸热反应，温度升高可增强底物分子热运动，促进产物合成[41]；(2)在一定的范围内，升高温度，可以使酶分子快速达到最佳的活性构象，从而增大酶活，LA 的转化率也随之增大[42]。当温度由50℃升高至60℃时，LA 的转化率却出现下降，这是由于温度过高会造成脂肪酶变性失活而导致LA 转化率降低。因此，选择50℃为最优的反应温度，进行后续实验。其次，探究了LA/十二醇摩尔比对LA 转化率的影响。由图12(b)可知，当LA/十二醇的摩尔比由1∶5增加1∶10时，LA 的转化率增加。这是由于酯化反应为可逆反应，适量增加十二醇可促进酯形成，同时可作为溶剂加强底物间的相互碰撞[43-44]。然而，当LA/十二醇的摩尔比由1∶10 增加到1∶25 时，LA的转化率降低，这是因为高浓度的正十二醇溶液会使酶分子发生不可逆的变性。最后，测定了反应不同时间时LA 转化率，由图12(c)可知，随着反应时间从0 h 延长到22 h，LA 转化率逐渐增加。反应22 h 后，酯化反应达到平衡，此时最大的LA 转化率为85.05%。综合以上实验可知，CALB@MMOSNs 催化合成乙酰丙酸十二酯的最优条件是：温度50℃、LA/十二醇的摩尔比1∶10、反应时间22 h。

2.2.4 CALB@MMOSNs 的重复使用性 将相同初始酶活的CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs 和N435应用于催化合成乙酰丙酸十二酯，探究它们的重复使用性。由 图 13可知，CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs 重复使用9 个循环后，LA 的转化率分别保持了68.94%和58.60%。然而，N435 作为催化剂重复使用9 次后转化率仅为29.83%。这是因为相较于树枝状纤维形材料(MMOSNs 和MMSNs)，基于大孔树脂材料的N435 容易在反应的过程中造成酶分子的泄漏，而且大孔结构不能很好地保护酶分子的构象，从而导致固定化酶活性降低导致LA转化率降低[29]。除此之外，CALB@MMOSNs 的疏水表面不仅可以避免水分子聚集，还可以有效实现CALB 的界面活化，从而表现出比无机硅载体制备的CALB@MMSNs更好的重复使用性。

图13 CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs和N435在酯化反应中的重复使用性Fig.13 Reusability of CALB@MMOSNs,CALB@MMSNs and N435 for esterification reaction

3 结论

本研究在改进Winsor Ⅲ体系双连续微乳液相的基础上，加入超顺磁性Fe3O4，制备了单分散核壳结构磁性有机硅载体MMOSNs。通过研究载体与酶分子之间的构效关系，实现了CALB@MMOSNs 的高效制备并用于催化酯化反应。与无机硅制备的CALB@MMSNs 和游离CALB 相比，CALB@MMOSNs表现出了更好的稳定性，实现了多批次重复使用。通过核壳结构磁性树枝状纤维形有机载体的设计构建，实现了磁性分离、高效固定化和界面激活的有效集成，为固定化脂肪酶的工业应用提供了新的技术路线。