创伤后应激障碍大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表达

丁金兰 韩 芳 石玉秀

（中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，创伤后应激障碍研究室，沈阳 110001）

创伤后应激障碍大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表达

丁金兰 韩 芳 石玉秀*

（中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，创伤后应激障碍研究室，沈阳 110001）

目的 探讨 PDE-4与 CREB在创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）大鼠杏仁核内的表达变化，为进一步阐明PTSD增强恐惧记忆机制研究提供基础。方法 成年雄性大鼠40只，随机分为PTSD模型1d、7d、14d组及正常对照组，采用单一连续刺激（single-prolonged stress，SPS）方法建立 PTSD模型，应用免疫组化及Real-time PCR方法检测大鼠杏仁核 PDE-4及 CREB蛋白表达及 mRNA表达变化。结果 PTSD造模后1d PDE-4蛋白表达显著降低，于 PTSD 7d时降至最低，第14d时回升，但仍显著低于正常，PDE-4mRNA表达与蛋白表达同步变化；CREB蛋白在 PTSD造模后1d表达显著增加，在 PTSD 7d时升至最高，第14d时下降，但仍显著高于正常，其 mPNA表达与蛋白表达同步变化。结论 创伤应激刺激能诱发大鼠杏仁核 PDE-4和 CREB的表达变化，且 PDE-4和 CREB表达呈反向变化。

PTSD；杏仁核；恐惧记忆；PDE-4；CREB

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指受到突发性巨大灾难或异乎寻常威胁所致的精神、心理创伤导致的长期持续性精神障碍。其核心症状可以简述为闯入性再体验、恐惧性增高及对未来失去信心等，为一种精神及心理失衡状态［1］。PTSD的典型症状之一是恐惧记忆增强，与恐惧关系最为密切的中枢核团是杏仁核，杏仁核属边缘系统，是与学习、恐惧记忆和情绪、行为功能密切相关的重要部位，是恐惧学习记忆的重要脑区［2］。磷酸二酯酶4（phosphodiesterase，PDE-4）是细胞内特异性的环磷酸腺苷（cAMP）水解酶，可以通过调节细胞内cAMP水平，使 cAMP水平下降，进而可以调节cAMP-PKA-CREB信号转导通路，影响细胞内CREB调节的基因的表达，使得参与学习记忆的一些蛋白质不能够被合成，从而干扰长期记忆的形成［3］。因此 PDE-4对 cAMP信号转导通路相关的记忆调节发挥着重要作用。那么，在 PTSD后杏仁核导致的恐惧记忆增强时PDE-4和CREB是如何变化的？其发病机制目前尚不完全清楚。因此本研究通过国际上公认的单一连续刺激（single-prolonged stress，SPS）模型，采用免疫组化、Real-time PCR对大鼠杏仁核内的PDE-4、CREB进行检测，旨在为研究 PTSD杏仁核导致恐惧记忆增强的发生机制提供基础。

材料和方法

1.材料

1.1 实验动物及分组

成年健康雄性 Wistar大鼠 40只，体重 150—180g，中国医科大学实验动物中心提供，随机分为4组，即 PTSD造模后的 1d、7d、14d组及正常对照组，每组10只。

2.方法

2.1 动物模型的建立和取材

采用日本文部省召开的“基础和临床的研究进展”会议确定的关于 PTSD模型— SPS刺激。SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理：大鼠禁锢2小时后，立即强迫游泳 20min（水深 40cm，水温25℃）。经过15min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再经任何刺激正常饲养至取材。

分别取 PTSD 1d、7d、l4d及正常对照组大鼠进行灌流固定。大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用0.01M PBS缓冲配置的 4%多聚甲醛心脏灌流，取出脑组织，并浸入同种固定液中后固定3h，然后浸于Holt’S液（30%蔗糖，0.1M PBS配制）中沉至瓶底。于恒冷冰冻切片机中冠状切片，片厚10μm。

2.2 免疫组织化学染色

切片经PBS洗3次，5min／次，BSA封闭，滴加多克隆兔PDE-4抗体、单克隆鼠 CREB抗体（购于Santa Cruz Biotechnology公司，工作浓度为 1：200），4℃过夜，滴加羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗（武汉，博士德）37℃ 30 min，SABC 37℃ 20min，PBS洗3次，5min／次，DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜（OLYMPUS，BX60，Japan）下观察，摄片。

应用MetaMorph／DPIO／BX41形态学图象分析系统软件，对上述免疫组织化学染色切片进行了半定量分析。在高倍（10×40倍）视野下，每张免疫组化染色切片取 5个视野，记录每个视野内阳性细胞光密度值，取平均光密度。每组5只大鼠，每只大鼠共选取 3张切片，具体半定量分析结果。

2.3 Real-time PCR

将各组大鼠麻醉后断头取脑，分离杏仁核的基底外侧核（basal lateral amgydala，BLA），利用 Trizol试剂提取总RNA，取1μg RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录和 PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术公司合成，各引物序列见表 1。以目的mRNA与内参 β-actin的比值表示相对表达水平，进行定量分析。

表1 PDE-4、CREB与β-actin引物序列Table 1 Primers for PDE-4，CREB and β-actin

2.4 统计学分析

所得数据使用 SPSS 17.0统计分析软件。计量资料用平均数 ±标准差（（±s））表示。应用单因素方差分析（ANOVA）检验，P＜0.05判为具有统计学意义。

结 果

1.PTSD对杏仁核 BLA内 PDE-4和 CREB的免疫反应性影响

免疫组化染色阳性信号为棕黄色，阳性表达的PDE-4染色位于细胞核和细胞质（图1）。PDE-4免疫组织化学染色显示，在正常对照组大鼠杏仁核中大量分布PDE-4阳性信号，而在 PTSD 1d，杏仁核中PDE-4表达明显降低；在 PTSD 7d时降至最低，较正常对照组有显著差异（图1C，图3，P＜0.05）。PTSD 14d时 PDE-4表达增多，但仍显著低于正常对照组。CREB的阳性表达主要位于细胞核（图2），结果显示，在PTSD后CREB表达明显增多，在PTSD 7d达到高峰，较正常对照组显著差异（图2C，图 3，P＜0.05）。PTSD 14d时CREB表达下降，但仍显著高于正常对照组。

图2 CREB免疫组化结果。A.正常对照组免疫反应阳性细胞；B.PTSD 1d组免疫反应阳性细胞；C.PTSD 7d组免疫反应阳性细胞；D.PTSD 14d组免疫反应阳性细胞Fig.2 The immunoreaction results of CREB；A.Immunoreaction in rats’amygdala of normal control group；B.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 1d group；C.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 7d group；D.Immunoreaction in rats’amygdala of SPS 14d group

2.PTSD改变杏仁核内 PDE-4和 CREB的 mRNA表达

定量PCR检测显示，杏仁核BLA内PDE-4 mRNA表达在 PTSD后降低，于PTSD 7d降至最低（表2），在PTSD14d时有所回升，但仍显著低于正常对照组，与免疫组织化学检测结果一致；CREB mRNA在正常组大鼠杏仁核 BLA中有少量表达，SPS刺激后，在PTSD 1d组mRNA的表达开始增多，PTSD 7d组达到最多，在 PTSD 14d组下降，但仍显著高于正常对照组（表2）。

图3 不同时间点大鼠杏仁核神经元PDE-4及CREB的表达情况（OD）（（±s））Fig.3 The expression of CREB and PDE-4 in different time of amygdala neurons.*P＜0.05 vs normal control group

表2 PDE-4、CREB的mRNA表达结果Table 2 The results of mRNA expression of PDE-4 and CREB.

讨 论

近年来，随着战争、社会暴力、重大交通事故和自然灾害等意外事件的逐渐增多，以及工作学习竞争压力加大，PTSD发生率也逐年增高。因严重影响人们身心健康而备受国内外学者关注。PTSD的典型症状之一是恐惧记忆增强，杏仁核，特别是 BLA，在条件化恐惧记忆中起关键作用，是恐惧记忆形成和储存的主要位点［4］。因此我们选择 BLA作为研究 PTSD恐惧记忆增强的切入点，这是阐明 PTSD发病机制的关键所在。

近年来研究发现，cAMP-PKA-CREB信号转导通路和长期记忆的形成密切相关，在学习和记忆形成的过程中有重要的作用［5］。神经细胞内 cAMP的浓度是由腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）和PDE-4的功能状态决定的［6］，但是PDE-4是细胞内特异性的cAMP水解酶，在调解细胞内cAMP积累过程中起着更为重要的作用。从而影响其介导的cAMP-PKACREB等信号通路。在神经系统中，CREB作为一种重要的核转录因子，在基因转录水平对学习记忆的调控起着“开关”的作用。其下游效应包括影响神经元的存活与生长、突触可塑性和长期记忆的形成［7］。CREB在介导 LTP及记忆过程中起到了关键性的作用，并推测 CREB活化的重要结果之一可能就是突触结构的可塑性增强［8］。

通过实验可知，在 SPS刺激后，PDE-4的浓度明显降低，在 PTSD 7d时降至最低，以后又逐渐恢复，CREB在 PTSD后明显增多，至PTSD 7d时增至最高，由此可推知细胞内 cAMP的浓度在 PTSD 7d达到最高从而使 CREB调节的恐惧记忆达到最高。因此，我们推测PTSD后恐惧记忆与 PDE-4下调，降解cAMP减少，促进 cAMP-PKA-CREB信号转导通路激活有关，这和我们前期研究的在 PTSD 7d时，杏仁核内 LTP的群体峰电位（population spike，PS）PS幅值达到最高，说明在 PTSD 7d时恐惧记忆最强的结果相符［9］。上述可说明PTSD后杏仁核导致的恐惧记忆增强，其作用机制与cAMP-PKA-CREB信号转导通路相关，并且杏仁核导致的恐惧记忆是在 PDE-4的调节下发生，并与 PDE-4的浓度呈反相的变化，与CREB浓度呈正相的变化。

［1］Johnson，LR，McGuire J，Lazarus R，et al.Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of PTSD.Neuropharmacol.，2012，62（2）：638-646

［2］Torfi Sigurdsson，Valerie Doyere，Christopher K Cain et al. Long-term potentiation in the amygdala：a cellular mechanism of fear learning and memory.Neuropharmacology，2007，52（1）：215-227

［3］Akkerman S，Blokland A，Prickaerts J.Mind the gap：Delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors.Neurobiology of Learning and Memory，2014，109：139-143

［4］StephenB.McHugh，Andre Marques-Smith，Jennifer Li et al. Hemodynamic responses in amygdala and hippocampus distinguish between aversive and neutral cues during pavlovian fear conditioning in behaving rats.European Journal of Neuroscience，2013，37（3）：498-507

［5］LeeYS，Silva AJ.The molecular and cellular biology of enhanced cognition.Nat Rev Neurosci，2009，10（2）：126-140

［6］HaiderS.Cyclic AMP level and phosphodiesterase activity during 17 alpha，20beta-dihydroxy-4-pregnen-3-one induction and theophylline inhibition of oocyte maturation in the catfish，Clarias batrachus.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2003，134（2）：267-274

［7］Hayward P.Presenilin dysfunction leads to memory and plasticity defects.Lancet Neuro，l 2004，3（6）：327

［8］LiQ，Zhao HF，Zhang ZF et al.Long-term administration of green tea catechins prevents age-related spatial learning and memory decline inC57BL／6 J mice by regulating hippocampal cyclic amp-response element binding protein signaling cascade.Neuroscience，2009，159（4）：1208-1215

［9］丁金兰，韩芳，石玉秀.PTSD大鼠杏仁核 LTP及乙酰胆碱酯酶表达的变化.解剖科学进展，2009，15（2）：212-215

Expression of PDE-4 and CREB in amygdala of rats with post-traumatic stress disorder

Ding Jinlan，Han Fang，Shi Yuxiu*
（PTSD Lab，Department of Histology and Embryology，Basic Medical College，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate PDE-4 and CREB expressions in the amygdala of rats with post-traumatic stress disorder（PTSD），in order to clarify the pathogenesis of fear memory enhancement in PTSD.Methods 40 male wistar rats were randomly divided into 1d，7d，14d groups of PTSD and the normal control group.The SPS（single-prolonged stress，SPS）method was used to set up the rat PTSD models.we used immunohistochemistry and Real-time PCR to detect the protein and mRNA expressions of PDE-4 and CREB.Results After PTSD stimulation，the protein expression of PDE-4 decreased significantly in comparison with that of the normal control group，plummeted on PTSD 7d，and then increased on PTSD 14d，but was still significantly lower than normal.PDE-4 mRNA expression synchronously changed with protein expression.In the PTSD groups，the protein level of CREB increased on day 1 of PTSD，peaked on PTSD 7d，and then decreased on PTSD 14d，but was still significantly higher than normal.The mRNA expression synchronously changed with protein expression.Conclusion Traumatic stress stimulation can induce PDE-4 and CREB expression changes in the amygdala of rats.Moreover，the expressions of PDE-4 and CREB are negatively correlated.

PTSD；Amygdala；Fear memory；PDE-4；CREB

R322.81

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.012

2015-04-30

2015-07-01

国家自然科学基金资助项目（31140060）

丁金兰，女（1981年），汉族，硕士

*通讯作者（to whom correspondence should be addressed）：shiyuxiu＠163.com