饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量及主要酶的活性变化

张继太 祝 雪 汪 焕 吴媛媛 彭 飞 张盛周

（安徽师范大学生命科学学院，生物环境与生态安全省级重点实验室，芜湖 241000）

饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量及主要酶的活性变化

张继太 祝 雪 汪 焕 吴媛媛 彭 飞 张盛周*

（安徽师范大学生命科学学院，生物环境与生态安全省级重点实验室，芜湖 241000）

目的 研究饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量和非特异性酯酶（NSE）、碱性磷酸酶（ALP）、过氧化物酶（POX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性变化。方法 应用冰冻切片、PAS染色法、酶组织化学技术及光密度定量分析。结果 饥饿期肝糖原含量显著降低，冬眠期肝糖原含量与活动期无显著差异；NSE活性在活动期最高，饥饿期显著降低，冬眠期活性最低；ALP和 POX活性在饥饿期均显著降低，冬眠期与活动期无显著差异；SDH活性在饥饿期和冬眠期均显著降低，活动期活性显著较高。结论 饥饿和冬眠期牛蛙肝糖原含量变化不一致，其他酶类活性变化相一致，不同时期肝糖原含量和酶活性的变化与牛蛙生理状态有着较好的适应性。

牛蛙；肝脏；饥饿；冬眠；组织化学

肝脏不仅为动物体内最大的消化腺，还是重要的代谢器官，其可通过合成与分解肝糖原调节血糖浓度，通过多种酶的作用参与物质的合成与转化及解毒等多种代谢活动［1-3］。研究表明，不同生理状态下动物肝脏的超微结构、肝糖原含量和各种酶的活性会发生明显变化以维持机体的能量平衡和代谢稳定［3-7］。

牛蛙（Rana catesbiana）隶属两牺纲无尾目蛙科，体大肉肥，为常见的食用蛙类，因其繁殖快、适应性强、生长迅速，抗逆性强且其养殖饲料易取等优点，牛蛙的人工养殖在我国得到了大规模推广［8］。牛蛙饱食后可耐饥饿，冬季气温下降后进入冬眠。目前，有关饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量和酶活性变化方面的研究尚未见报道，本文采用PAS糖原染色法和酶组织化学技术对饥饿与冬眠期牛蛙肝脏糖原含量及非特异性酯酶（NSE）、碱性磷酸酶（ALP）、过氧化物酶（POX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）等4种酶的活性变化进行了研究，旨在增进对不同生理状态下牛蛙肝脏生理机能的认识，为牛蛙的人工养殖提供基础资料。

材料和方法

1.实验材料

成体牛蛙购自芜湖黄山西路菜市场。9月份取活动期饱食牛蛙 12只，随机选取 6只穿刺毁髓，迅速解剖，取出肝脏置于 －70℃备用，另6只放入长宽高分别为 100、50和50 cm玻璃饲养箱中，用纱布覆盖容器上口，饥饿10 d，穿刺毁髓，解剖，取出肝脏置于 －70℃备用。12月份取源自与活动期同一养殖场冬眠期成体牛蛙6只，实验室继续冬眠 15 d，穿刺毁髓，解剖，取出肝脏。将肝脏切成约0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm的小块，放在组织支撑器上，滴加冷冻包埋剂后放入冰冻切片机中低温固化后切片，切片厚5 μm。

2.组织化学方法

肝糖原检测采用 PAS染色法，参考张继太等［9］的方法进行；酶组织化学染色参考韦金鑫等［8］的方法进行，略有改动。

2.1 PAS染色法

冰冻切片入0.5%高碘酸氧化约7 min，流水冲洗5 min后再用蒸馏水浸洗2－3次；冰箱取出无色品红待至室温后避光染色15－20 min；用0.5%的偏重亚硫酸钠漂洗两次，每次约1 min，蒸馏水洗后苏木精复染1 min，流水冲洗，蒸馏水浸洗。

2.2 非特异性酯酶（NSE）

NSE作用液成分为 10mg α-醋酸钠酯、0.4ml丙酮、40 μl 0.1mol／L PBS（pH 7.4）、2.4 ml六偶氮化副品红，混合后用 2mol／L NaOH溶液调 pH至5.8，此溶液在 30min内使用。将作用液滴加在组织冰冻切片材料上，室温下反应 10min，蒸馏水浸洗。

2.3 碱性磷酸酶（ALP）

ALP作用液成分为 0.1mol／L碱性磷酸酶缓冲液1.5ml、5%硝基蓝四唑（NBT）溶液15 μl和5% 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（BCIP）溶液7.5 μl，混匀后需在30 min内使用。将作用液滴加在冰冻切片材料上显色20min，蒸馏水浸洗。

2.4 过氧化物酶（POX）

POX作用液成分0.06mol／L 3，3-二氨基联苯胺（DAB）溶液 50μl、3.6%H2O210μl、0.1mol／L Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液1.0ml。将混合后的作用液滴加在冰冻切片上，于37℃恒温箱中反应20 min，蒸馏水浸洗。

2.5 琥珀酸脱氢酶（SDH）

SDH作用液成分为5%硝基蓝四唑（NBT）溶液15 μl、0.1mol／L PBS（pH 7.4）1.5ml、30mg琥珀酸钠盐，将混匀后的作用液滴加在冰冻切片上，室温显色45min，蒸馏水浸洗。

3.光密度测定与数据统计分析

在Olympus BX61型显微镜下观察并拍照，采用Image-Pro Plus图像分析软件对染色阳性部位进行光密度分析，测出切片中阳性部位的累积光密度（integrated optical density，IOD）和面积，算出平均光密度（mean optical density，MOD）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异显著性比较，P＜0.05为差异显著。

结 果

光镜下，牛蛙肝糖原及4种酶在肝组织中均呈现明显的组织化学颜色反应，经光密度定量分析后，不同时期牛蛙肝脏糖原含量及非特异性酯酶（NSE）、碱性磷酸酶（ALP）、过氧化物酶（POX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性变化见表1。

表1 不同时期牛蛙肝脏糖原含量及4种酶的活性变化Table 1 The changes of the glycogen content and activities of four kinds of enzymes in the liver of bullfrog during different periods

1.肝糖原

染色后肝糖原呈红色或紫红色（图1－图3），主要位于细胞质内，成颗粒状分布。活动期糖原含量显著较高（P＜0.05），颗粒较大且分布较均匀，冬眠期肝糖原含量与活动期差异不显著（P＞0.05），饥饿期肝糖原含量显著降低（P＜0.05），颗粒较小且分布不均匀。

2.非特异性酯酶（NSE）

NSE活性部位呈棕褐色（图4－图6），主要位于肝脏细胞的胞质内，活动期酶活性最高（P＜0.05），阳性部位呈较大颗粒状且在肝组织中均匀分布，饥饿期酶活性显著降低（P＜0.05），冬眠期酶活性最低（P＜0.05），阳性部位颗粒状较小且分布不均匀。

3.碱性磷酸酶 （ALP）

ALP活性部位为蓝紫色（图7－图9），主要位于细胞膜上，活动期酶活性显著较高，酶颗粒较大且较为密集，饥饿期酶活性显著降低（P＜0.05），酶颗粒较小且较为疏散，冬眠期酶活性略有降低，但与活动期无显著差异（P＞0.05）。

4.过氧化物酶 （POX）

POX活性部位呈棕黄色（图10－图12），主要位于肝细胞的胞质内且呈较大颗粒状分布，不同生理时期颗粒大小无明显差别，但颜色深浅不同，饥饿期酶活性显著降低，颜色较浅，冬眠期和活动期酶活性显著较高（P＜0.05），颜色较深，二者间酶活性无显著差异（P＞0.05）。

5.琥珀酸脱氢酶（SDH）

图1 活动期肝脏糖原；图2 冬眠期肝脏糖原；图3 饥饿期肝脏糖原；图 4 活动期非特异性酯酶；图5 冬眠期非特异性酯酶；图6 饥饿期非特异性酯酶；图7 活动期碱性磷酸酶；图8 冬眠期碱性磷酸酶；图9 饥饿期碱性磷酸酶；图10 活动期过氧化物酶；图11 冬眠期过氧化物酶；图12 饥饿期过氧化物酶；图13 活动期琥珀酸脱氢酶；图 14 冬眠期琥珀酸脱氢酶；图15 饥饿期琥珀酸脱氢酶；标尺：50μmFig.1 liver glycogen during active period；Fig.2 liver glycogen during hibernation；Fig.3 liver glycogen during starvation；Fig.4 NSE during active period；Fig.5 NSE during hibernation；Fig.6 NSE during starvation；Fig.7 ALP during active period；Fig.8 ALP during hibernation；Fig.9 ALP during starvation；Fig.10 POX during active period；Fig.11 POX during hibernation；Fig.12 POX during starvation；Fig.13 SDH during active period；Fig.14 SDH during hibernation；Fig.15 SDH during starvation；Scale bar：50 μm

SDH活性部位呈蓝紫色（图13－图15），主要位于肝细胞的胞质内且呈颗粒状分布，不同生理时期颗粒密集程度不同，活动期 SDH活性显著较高（P＜0.05），颗粒分布较为密集，颜色较深，饥饿期和冬眠期SDH活性显著降低（P＜0.05），染色较浅，二者间酶活性无显著差异（P＞0.05）。

讨 论

肝糖原是人和动物体内的贮备多糖，肝糖原在酶促作用下合成和分解以维持血糖浓度稳定。本研究显示，饥饿状态下牛蛙肝糖原含量显著降低，表明牛蛙饥饿时会分解肝糖原用于维持自身的生命活动，与鱼类、哺乳动物等饥饿时肝糖原含量变化对于饥饿的适应性相一致［6，7］；冬眠期牛蛙肝糖原含量与活动期无显著差异，表明冬眠前牛蛙会储备较多肝糖原，这支持肝糖原是两栖动物冬眠期的主要储能和抗冻保护物质的观点［2-5］，提示在牛蛙的养殖实践中可根据肝糖原的含量来判断牛蛙的营养状况从而合理饲喂以保证其安全越冬。

NSE是一种水解酶，主要参与酯类物质的水解［10］。本研究显示，活动期牛蛙肝脏NSE活性最高，饥饿期NSE活性显著降低，这可能是对饥饿期肝细胞内酯类营养物质减少的适应。冬眠期NSE活性最低，表明冬眠期牛蛙肝细胞对酯类利用较少，可能与肝细胞中储存有大量肝糖原，机体主要通过分解肝糖原获取能源物质有关，这也进一步表明蛙类冬眠期主要通过消耗肝糖原来维持机体代谢活动。

ALP为磷酸酶的一种，结合于细胞膜上，主要参与脂类、葡萄糖、钙和无机磷酸盐等营养物质的吸收［11］。本研究显示，活动期牛蛙肝脏 ALP活性显著高于其他时期，饥饿期牛蛙肝脏ALP活性最低，这一结果与泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）在饥饿状态下肝脏ALP活性的变化相一致［6］，表明饥饿状态下牛蛙肝细胞的物质代谢活动明显变弱。冬眠期 ALP活性仍较高，与活动期无显著差异，表明冬眠期牛蛙肝细胞仍具有较强的吸收营养物质的能力。

POX存在于细胞的过氧化物酶体中，可以降低或消除细胞代谢过程中产生的过氧化氢、酚类和胺类等毒性物质，对机体起着保护作用［12］。本研究显示，活动期牛蛙肝脏POX活性显著较高，活动期牛蛙肝细胞代谢较为旺盛，会产生较多代谢毒物，较高的 POX活性可清除机体代谢产生的有毒物质，更好地起到保护作用。饥饿期POX活性最低，这与饥饿状态下牛蛙肝脏代谢活动较弱，产生的代谢有毒物质较少相适应。冬眠期牛蛙肝脏POX活性保持较高水平，与活动期无显著差异。有研究表明，蛙类冬眠期处于缺氧状态，会产生较多自由基物质［13，14］，可见，冬眠期肝脏 POX活性保持较高水平有利于保护机体免受由缺氧引起的自由基损伤。

SDH是线粒体三羧酸循环的关键酶，SDH的活性常作为判定三羧酸循环运行强弱的指标［15］，本研究显示，饥饿期与冬眠期牛蛙肝脏SDH活性均显著降低，这与小白鼠肝脏 SDH活性变化对饥饿与寒冷的适应性基本一致［7］。活动期SDH活性较高，表明正常生理条件下肝细胞需要通过三羧酸循环产生足够多的 ATP以维持机体正常的代谢活动，而饥饿期体内营养物质减少，SDH的活性降低可减少能量消耗；冬眠期动物的基础代谢率降低，SDH活性降低可使三羧酸循环运行减慢以适应冬眠期较低的能量消耗。张建萍等［16］对虎斑颈槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）肝脏 SDH活性受温度影响的研究显示，5～15℃范围内 SDH表现出较低活性，可见，冬季气温过低也是造成冬眠期肝脏SDH活性降低的原因。

总之，饥饿和冬眠期牛蛙肝糖原含量及各种酶活性的变化与肝脏生理功能及个体生命活动状态是相适应的。冬眠期肝糖原含量及4种酶活性的变化与饥饿期有相似之处，亦存在明显差异，反映出冬眠与饥饿后的生理变化既有相似性又存在差异。

［1］梁扩寰，李绍白.肝脏病学.北京：人民卫生出版社，2006

［2］Jenkins JL，Swanson DL.Liver glycogen，glucose mobilization and freezing survival in chorus frogs Pseudacris triseriata.J. Therm Biol，2005，30：485-494

［3］冯照军，季丽萍，施雯，等.中华蟾蜍糖原含量的季节变化.动物学报，2007，53（6）：1048-1053

［4］米志平，苏学辉，代庆阳.中华大蟾蜍冬眠前与出眠初期肝细胞超微结构的观察.四川师范学院学报（自然科学版），2000，21（1）：98-101

［5］Steiner AA，Petenusci SO，Brentegani LG，et al.The importance of glucose for the freezing tolerance／intolerance of the anuran amphibians Rana catesbeiana and Buffo paracnemis. Rev Bras Biol，2000，60：321-328

［6］杜启艳，王萍，王友利，等.长期饥饿和再投喂对泥鳅不同组织糖原、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的影响.江西师范大学学报（自然科学版），2008，32（4）：488-493

［7］许晓利，张艳，熊希凯.骤冷与饥饿对小鼠肝脏影响的实验研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1997，6（3）：284-288

［8］韦金鑫，郭慧，宋华，等.牛蛙消化道黏膜5种酶的分布.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（4）：316-319

［9］张继太，祝雪，张盛周.两种切片方法检测肝糖原染色效果的比较.中国组织化学与细胞化学杂志，2014，23（6）：548-550

［10］Krugmann J，Neuenfeld M，Krautschick I.Peroxide treatment changes activity of non-specific esterase in vascular endothelium of isolated pig aorta in vitro.Experimental and Toxicologic Pathology，1997，49（5）：355-359

［11］Lallès JP.Intestinal alkaline phosphatase：multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet.Nutr Rev，2010，68（6）：323-332

［12］许燕，杨洁，孙静秋，等.凡纳滨对虾不同组织内 SOD、

Changes in glycogen content and activities of some key enzymes in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation

Zhang Jitai，Zhu Xue，Wang Huan，Wu Yuanyuan，Peng Fei，Zhang Shengzhou*
（Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province，College of Life Sciences，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Objective To investigate changes in the glycogen content and the activities of non-specific esterase（NSE），alkaline phosphatase（ALP），peroxidase（POX）and succinate dehydrogenase（SDH）in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation.Methods Frozen sectioning，PAS staining，enzyme-histochemical technique and optical density analysis were used.Results The glycogen content wass significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of NSE was highest during the active period，lower during starvation，and lowest during hibernation.The activities of ALP and POX were significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of SDH was significantly decreased during starvation and hibernation，but higher during the active period.Conclusion The change of hepatic glycogen content is inconsistent during starvation and hibernation，while the changes of other enzymatic activities are consistent.The changes of glycogen content and enzymatic activities in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation are rational adaptive responses to the changes of the physiological status.

Rana catesbiana；Liver；Starvation；Hibernation；Histochemistry

Q959

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.016

2015-06-29

2015-09-16

安徽省自然科学基金（11040606M75）；国家级大学生校外实践教育基地大学生创新训练计划项目；本科生优秀毕业论文培育计划项目（pyjh2013206）；生物环境与生态安全省级重点实验室建设基金

张继太，男（1991年），汉族，本科生

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：

szzhang＠mail.ahnu.edu.cn