TIM4在过敏性哮喘患者单核细胞和哮喘小鼠模型肺组织表达增高

蔡鹏程 魏 燕 胡丽华

（华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉 430022）

TIM4在过敏性哮喘患者单核细胞和哮喘小鼠模型肺组织表达增高

蔡鹏程 魏 燕 胡丽华*

（华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉 430022）

目的 探讨 T细胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）在过敏性哮喘中的表达及与疾病之间的关系。方法 随机选取了30例过敏性哮喘患者和30例健康对照的全血标本，流式细胞术检测了 TIM4在单核细胞的表达水平，库尔特计数法检测了嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞占白细胞的比例。免疫组织化学法检测了哮喘小鼠模型和对照小鼠肺组织 TIM4的表达水平。结果 哮喘患者组 TIM4阳性细胞占外周血单核细胞的2.51%，显著高于健康对照组的0.68%；哮喘患者组的嗜酸性粒细胞比例（3.88%）显著高于健康对照组（1.23%）；但TIM4表达水平与嗜酸性粒细胞，单核细胞与淋巴细胞之间未见相关性。哮喘小鼠模型气道上皮细胞TIM4的表达水平高于小鼠对照组。结论 TIM4在过敏哮喘中的表达水平升高，可能参与了过敏性哮喘的免疫失衡机制。

TIM4；过敏性哮喘；嗜酸性粒细胞；淋巴细胞

过敏性哮喘是一种以气道高反应性为特征的可逆性气道阻塞性疾病，淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等参与了气道的慢性炎症。Th1／Th2淋巴细胞的失衡是过敏性哮喘发病机制的重要环节。T细胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）主要表达于巨噬细胞［1］，树突状细胞等抗原递呈细胞表面，与 TIM1结合后刺激 Th2细胞的活化，促进Th1／Th2平衡向Th2细胞偏移。已有研究表明TIM4表达的升高与胃肠道过敏性疾病的发病有关［2］，而 TIM4在过敏性哮喘中的表达水平知之甚少。因此，我们采用流式细胞术及免疫组织化学染色分别检测了哮喘患者外周血单个核细胞及小鼠哮喘模型肺组织 TIM4的表达水平，以明确其在过敏性哮喘发病机制中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1 材料来源

过敏性哮喘患者30例，男16例，女14例，年龄12-60岁，均来自于华中科技大学同济医学院附属协和医院门诊部和住院部。过敏性哮喘诊断标准：（1）反复发作喘息、气急、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、病毒性上呼吸道感染，运动等有关。（2）发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。（3）上述症状可经治疗缓解或自行缓解。（4）除外其它疾病所引起的喘息、气急、胸闷和咳嗽。（5）临床表现不典型者应至少具备以下一项试验阳性：①支气管激发试验或运动试验阳性；②支气管舒张试验阳性［一秒钟用力呼气容积（FEV1）增加15%以上且 FEV1增加绝对值 ＞200 ml］；③最大呼气流量（PEF）日内变异率或昼夜波动率≥20%。符合1～4条或 4、5条者可以诊断为支气管哮喘；④最少一种变应原特异 IgE阳性或血浆 IgE高于正常参考值。对照组为协和医院体检中心的健康体检者30例，男12例，女18例，年龄10－60岁，均排除了心脑血管、肝肾疾病、自身免疫性疾病和变应性疾病的症状和病史。采集哮喘患者用药前及健康体检者抗凝全血标本，12h内完成检测。本研究获得华中科技大学同济医学院伦理委员会的批准，所有研究均经研究对象知情同意。

1.2 动物模型

用卵清白蛋白（OVA）被动致敏复制小鼠哮喘模型，1月龄大小 SPF级雄性小鼠，随机分为正常对照组和哮喘组。于第1天对哮喘组每只左下腹腔注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常对照组注射0.5ml生理盐水。于第9天第二次对哮喘组注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常对照组注射0.5ml生理盐水。于第 14天开始每周 1，3，5哮喘组雾化2%OVA 100 ml，时间30 min；正常对照组雾化等量生理盐水；两组每次雾化前左腹腔注射0.2ml生理盐水。2个月后留取肺组织标本。

2.方法

2.1 流式细胞术

100μl人外周血加入5μlTIM4抗体，震荡混匀后避光孵育30min，加500μl红细胞裂解液，震荡混匀避光裂解5min，待试管内液体变为红色透明即可离心（1500r／min离心5min），轻弃上清后加入500μl PBS缓冲液洗涤一次，振荡混匀后采用贝克曼流式细胞仪进行检测，记录 TIM4阳性细胞的百分比。

2.2 血常规检测

用贝克曼血球仪对哮喘患者组与健康对照组的各个标本进行检测，记录淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞占白细胞的百分比。

2.3 TIM4表达的免疫组织化学检测

小鼠新鲜肺组织标本经 10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片后按照说明书操作进行免疫组化染色。经脱蜡、脱水及水化后，相继滴加抗 TIM4抗体、生物素标记的二抗、链霉素蛋白 －过氧化物酶溶液及二氨基联苯胺（DAB）溶液。

3.统计学分析

TIM4百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比采用非参数检验（Mann Whitney test），相关 性分 析用斯 皮尔曼 秩检 验（Pearman’s rank test），以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.过敏性哮喘患者血 TIM4阳性单个核细胞比例高

过敏性哮喘患者组与健康对照组的年龄及性别构成比例差异均无统计学意义。过敏性哮喘组全血中 TIM4阳性的单个核细胞占总单个核细胞的2.51%，高于健康对照组的 0.68%，差异具有统计学意义。同时，哮喘组嗜酸性粒细胞百分比亦明显高于健康对照组，差异具有统计学意义；而淋巴细胞及单核细胞百分比在两组间无明显差异（图1）。

2.TIM4的表达水平与嗜酸性粒细胞之间不具相关性

相关性分析显示，在过敏性哮喘患者外周血中，单个核细胞TIM4的表达水平与嗜酸性粒细胞百分比之间的相关系数为0.373，P值为0.259，两者不具相关性。TIM4表达水平与单核细胞百分比，淋巴细胞百分比之间亦无相关性（表1）。

表1 TIM4表达水平与外周血嗜酸性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的相关性Table 1 Correlations between TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood

图1 过敏性哮喘患者组和健康对照组外周血 TIM4表达水平及嗜酸性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞百分比Fig.1 TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood of atopic asthma patient group and healthy control group

3.小鼠哮喘模型大气道和中等气道上皮细胞 TIM4表达增高

为了研究 TIM4在肺部的表达情况，我们建立了OVA被动致敏的小鼠哮喘模型，采用免疫组织化学技术对小鼠肺组织的 TIM4进行了染色，以出现棕黄色颗粒为阳性反应。在小鼠哮喘模型中，气道内分泌物增多，平滑肌层增厚，TIM4阳性表达主要集中于气道的表层，以气道上皮细胞最为显著，TIM4的表达分布于胞膜及胞浆，以胞膜更为明显；同时在肺结缔组织也观察到一部分表达TIM4的细胞，TIM4的表达亦分布于胞膜及胞浆。与对照组小鼠相比，哮喘模型大气道和中等气道上皮细胞 TIM4的表达程度明显增强；但小气道上皮细胞 TIM4的表达与对照组差别并不明显（图2）。

图2 小鼠哮喘模型肺组织 TIM4的表达分布。a.对照组大气道；b.哮喘组大气道；c.对照组中气道；d.哮喘组中气道；e.对照组小气道；f.哮喘组小气道；箭头指示为气道上皮Fig.2 Expression and distribution of TIM4 in asthmatic mice model.a.Large airway of control group；b.Large airway of asthmatic group；c.Medium airway of control group；d.Medium airway of asthmatic group；e.Small airway of control group；f.Small airway of asthmatic group；The arrow indicates airway epithelium

讨 论

TIM基因家族是2001年 McIntire发现的一个参与了对T细胞免疫功能调节的基因家族［3］，其所在区域5q31-33是哮喘的遗传易感区。人类 TIM基因家族包含TIM1，TIM3，TIM4三个分子，主要调节Th0细胞向Th1／Th2细胞的分化发育，调节Thl／Th2免疫平衡的偏移，从而影响过敏性哮喘、器官移植免疫耐受等疾病的进展。TIM1高表达于活化的 Th2细胞，TIM4是 TIM1的受体之一，TIM4与 TIM1结合后促进 Th2细胞的激活［4］。因此，TIM4表达水平的变化很可能影响Th1／Th2淋巴细胞的平衡。已有多文献报道了 TIM4基因的遗传变异与过敏性哮喘的发病存在关联性［5-7］，且 TIM4表达增高可能是食物过敏，过敏性关节炎的发病因素之一［8-9］。

本研究结果显示，过敏性哮喘患者外周血单个核细胞 TIM4阳性率高于健康对照组，提示 TIM4表达的升高可能与哮喘的发病有关。研究表明，阻断树突状细胞上 TIM4与 TIM1的相互作用，能抑制Th2细胞的活化，该功能已在过敏性肠炎、肾缺血再灌注损伤中得到证实［10-11］。TIM4表达的升高可激活更多的 TIM1分子，导致 T细胞平衡向 Th2细胞偏移，引发Th2细胞介导的炎症反应。此外，过敏性哮喘患者嗜酸性粒细胞百分比也高于健康对照，该结果与马萍等的报道一致［12］，但淋巴细胞、单核细胞百分比在两组间差异无统计学意义。嗜酸性粒细胞主要抑制嗜碱性粒细胞和肥大细胞合成与释放活性物质，吞噬其释出颗粒，并分泌组胺酶破坏组胺，从而限制过敏反应，因此嗜酸性粒细胞水平的增高与是机体应对过敏性哮喘的自我保护机制。在哮喘患者中，TIM4表达水平与嗜酸性粒细胞百分比并无相关性，可能与它们在过敏性哮喘发病机中不同的作用有关，提示多种因素参与了对嗜酸性粒细胞水平的调控。

病毒感染、吸入冷空气、运动等是哮喘常见的诱发因素，它们可上调气道炎症的主要细胞—气道上皮细胞的反应性。上皮细胞反应性增高表现为通透性增加、炎症因子的表达分泌增强等，从而引起黏液分泌增多、气道阻塞及邻近的支气管平滑肌痉挛，最后导致哮喘的发作。此外，因免疫失衡导致哮喘相关的细胞因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α等分泌增加，这些细胞因子可作用于局部上皮细胞及免疫细胞，介导炎症介质的产生，从而改变局部的免疫微环境参与哮喘长期慢性炎症的形成。前期研究结果显示TIM4可表达于人的气道上皮细胞株16HBE。为了研究 TIM4在过敏性哮喘中的致病机理，我们建立了小鼠哮喘模型，并用免疫组化的方法对肺部TIM4的表达进行了研究，结果显示 TIM4阳性分布区域包括气道表层及结缔组织，主要位于气道表层，其中以气道上皮细胞表面最为明显，小鼠哮喘模型的大气道及中气道的 TIM4阳性率高于对照组。Backer等在小鼠实验中发现［13］，外来抗原进入呼吸道后被树突状细胞转移到纵隔淋巴结，在淋巴结髓质区巨噬细胞大量表达 TIM4。当 TIM4敲除后，淋巴结髓质巨噬细胞对抗原特异 T细胞的吞噬减少，降低了呼吸系统的免疫耐受［14］。TIM4可表达于气道及肺结缔组织内的抗原递呈细胞，如树突状细胞，单核细胞表面等，TIM4表达的升高可增强这些细胞的抗原递呈功能，促进Th2细胞的激活，最终导致过敏性哮喘的发生。TIM4除了可以与 TIM1结合，还能与磷脂酰丝氨酸结合促进细胞对凋亡体的吞噬。位于气道表层的上皮细胞 TIM4的高表达可增强上皮细胞对凋亡体的吞噬，从而参与局部免疫微环境及免疫炎症的调控。

综合本研究结果，在哮喘患者及小鼠哮喘模型中，均观察到TIM4的表达上调，位于肺部的树突状细胞，巨噬细胞胞膜表面TIM4可与 TIM1结合促进Th2细胞的活化，导致 T细胞平衡向 Th2细胞偏移，最终导致过敏性哮喘的发生。而血液中及气道表层的 TIM4的表达上调，则可能通过介导单核细胞，上皮细胞等对磷脂酰丝氨酸的吞噬来调控免疫炎症，影响相关细胞的功能的发挥，如粘液分泌，气道反应增强等来参与哮喘的发病。因此，TIM4在过敏性哮喘的发生发展中可能起着重要作用，但鉴于 TIM4生物学功能的多样性及免疫微环境的复杂性，TIM4在哮喘免疫发病机制中的具体作用有待进一步深入研究。

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High expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4 in monocytes of atopic asthma patients and lung tissue of asthmatic mouse model

Cai Pengcheng，Wei Yan，Hu Lihua*
（Clinical Laboratory Department of Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science＆Technology，Wuhan 430022，China）

Objective To investigate the expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4（TIM4）in atopic asthma and the relationship between TIM4 and atopic asthma.Methods The peripheral blood of 30 atopic astnma patients and 30 healthy controls were randomly selected.The expression level of human TIM4 was detected by flow cytometry.The percentages of eosinophils，monocytes and lymphocytes in peripheral blood were measured by Kurt count method.The TIM4 expression level in asthmatic model and control mice was analyzed by immunohistochemistry.Results The percentage of TIM4 positive cells in peripheral blood mononuclear cells of asthmatic patients was 2.51%，significantly higher than in the healthy group（0.68%）.The percentage of eosinophils was also higher in asthmatic patients（3.88%）than in the healthy group（1.23%）.However，there was no correlation between the expression level of TIM4 and the percentages of eosinophils，monocytes or lymphocytes.The TIM4 expression in bronchial airway cells of asthmatic mice was higher than that in control mice.Conclusion The expression of TIM4 is increased in atopic asthma，which indicates that TIM4 may play a role in the immune imbalance mechanism of atopic asthma.

TIM4；Atopic asthma；Eosinophile；Lymphocyte

R562.25

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.014

2015-06-01

2015-09-11

国家自然科学基金资助（81200020）

蔡鹏程，男（1982年），汉族，博士研究生

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：xhhulh＠126.com