GFER抑制四氯化碳对 HepG2细胞的损伤

高 见 董凌月 安 威

（首都医科大学细胞生物学系，肝脏保护与再生调节北京市重点实验室，北京 100069）

GFER抑制四氯化碳对 HepG2细胞的损伤

高 见 董凌月 安 威*

（首都医科大学细胞生物学系，肝脏保护与再生调节北京市重点实验室，北京 100069）

目的 探讨 HepG2细胞内生长因子 ERV1样基因（growth factor Erv1-gene，GFER）表达降低后对四氯化碳（CCl4）诱导的细胞损伤的影响，以进一步明确GFER对于肝细胞的保护作用。方法 首先将 GFER siRNA转染入 HepG2细胞，72 h后收集细胞并通过Western Blot检测GFER的表达以明确沉默效率。再次将GFER siRNA转染入HepG2细胞72 h后，用CCl4处理细胞6 h和24 h，检测细胞内 ATP的含量，caspase-3的活性，并应用MTS方法测定细胞的增殖能力以及 TUNEL方法检测细胞凋亡。结果 Western blot结果显示转染 GFER siRNA后细胞内 GFER的表达降低。CCl4处理细胞6 h后，GFER表达降低使细胞的增殖能力下降，细胞内 ATP含量增加，细胞凋亡更为明显。CCl4处理 24 h后，GFER表达降低使细胞的增殖能力进一步下降，Caspase 3活性进一步升高，凋亡细胞数目显著增多，而 ATP的含量明显下降。结论 GFER表达降低促进 CCl4对 HepG2细胞的损伤。

生长因子样基因；四氯化碳；HepG2；caspase-3；凋亡

肝脏是人体重要的器官，具有复杂的生物学功能。肝脏具有很强的再生功能，肝大部分切除或受到各种毒物、药物损伤后均可以启动肝再生过程［1］。多种生长因子、细胞因子参与肝再生进程，其中肝脏自身产生的肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）因具有很强的促肝细胞增殖作用，一直备受关注。HSS最初是在1975年从初断乳的大鼠肝脏中提取的一种可以刺激肝部分切除后再生的的活性物质［2，3］。随后对 HSS基因及蛋白质结构的研究 发现，HSS与酵母ERV1（essential for respiration and viability）具有较高的同源性，属于同一家族，因此又将HSS基因称为生长因子 ERV1样基因（Growth Factor Erv1-Like gene，Gfer）［4］。Gfer主要定位于线粒体膜间隙中，具有巯基氧化酶和细胞色素c还原酶的活性，参与线粒体的氧化磷酸化过程［5-7］。同时，Gfer还可以稳定线粒体膜电位，抑制线粒体途径的细胞凋亡，是肝细胞内至关重要的存活因子之一［8］。除此之外，还有研究表明 Gfer可以减轻 CCl4或氨基半乳糖对肝细胞的毒性损伤，具有很强的肝细胞保护作 用［9-10］。

有关 Gfer在 CCl4对肝细胞损伤中的保护作用研究，多采用 Gfer过表达，而关于 Gfer沉默在CCl4对肝细胞损伤中作用则鲜少报道。RNAi是一种由双链RNA引起的序列特异性基因沉默。它通过产生小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），通过一系列反应，使与siRNA有同源序列的mRNA降解，从而达到抑制目的基因表达的目的。因此本实验通过转染 Gfer siRNA的方法使 HepG2细胞中Gfer的表达下调，随后用CCl4处理细胞，探究Gfer表达下调后在 CCl4对肝细胞损伤中的作用，从而进一步证实Gfer对肝脏具有重要的保护功能。

材料和方法

1.材料

1.1 细胞

HepG2细胞系（首都医科大学基础医学院细胞生物学实验室保存）。

1.2 siRNA

Gfer siRNA和 scramble siRNA（与人和鼠基因序列没有同源的 siRNA）合成于美国 GE Dharmacon公司。

1.3 主要试剂

CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay试剂盒（美国Promega公司）；Caspase-Glo®3／7Assay试剂盒（美国Promega公司）；CellTiter 96®Aqueous试剂盒（美国Promega公司）；In Situ Cell Death Detection Kit（瑞士 Roche公司）；BCA蛋白质定量试剂盒（美国Pierce公司）；Gfer多克隆抗体（本室制备）。

2.方法

2.1 细胞培养

HepG2细胞生 长在含 10%胎 牛血 清 的 高糖 DMEM培养液中，在 37℃无菌条件下，于 95%的相对湿度、5%CO2恒温二氧化碳培养箱中培养，每48至 72 h传代 1次，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 细胞转染

按DharmaFECTTMtransfection reagent说明书（美国GE Dharmacon公司）的操作方法将siRNA转染至HepG2细胞中，继续培养72 h，收集细胞提取蛋白质，用于Western Blot实验。

2.3 Western Blot

在4℃条件下，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白质后，依照 BCA Protein Assay试剂盒说明书测定所提取样品蛋白质的含量。每个样品取70 μg蛋白质于100℃煮沸5 min后立即置于冰上5 min。将样品置于12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳 2 h，采用湿转的方法，恒压 80 V，2 h将蛋白质转印至PVDF膜上，将膜放入含5%脱脂奶粉的 TBST溶液中封闭1 h，用抗体稀释液将Gfer多克隆抗体按 1∶1000稀释后与膜 4℃共同孵育过夜，羊抗兔二抗按 1∶5000稀释后与膜室温孵育1 h，于 X线片上曝光，常规显影定影。洗膜液将 Gfer多克隆抗体洗去后，再次将膜与GAPDH单克隆抗体孵育，作为实验内参。

2.4 CCl4处理 HepG2细胞

将 Gfer siRNA和 scramble siRNA分别转染入HepG2细胞，72 h后换用无血清培养基培养 6 h，加入含0.25%（v／v）DMSO的CCl4（1%v／v）或0.25%（v／v）DMSO，继续孵育6 h或24 h。

2.5 MTS实验

依据CellTiter 96®Aqueous试剂盒（Promega）说明书操作，步骤如下：CCl4处理细胞 6 h或 24 h后，弃培养基，加入100 μl新鲜的无血清、无双抗的培养基。CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent室温静置使其完全融化，取20 μl加入细胞培养基中。在37℃，5%CO2恒温二氧化碳培养箱中继续培养2 h，在490nm读取吸光度值并记录。

2.6 ATP含量测定

根据 CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay试剂盒（Promega）说明书操作，步骤如下：CCl4处理细胞6 h或24 h后，弃培养基，加入100 μl新鲜的无血清、无双抗的培养基后，再加入等体积的Cell-Titer-Glo®试剂。定轨振荡器上振荡混合2 min，诱导细胞裂解。室温继续孵育10 min，使荧光信号值稳定，在荧光检测仪中检测荧光信号。

2.7 Caspase-3活性检测

根据 Caspase-Glo®3／7Assay试剂盒（Promega）说明书操作，步骤如下：CCl4处理细胞 6 h或24 h后，弃培养基，加入 100 μl新鲜的无血清、无双抗的培养基后，再加入等体积的 Caspase-Glo®3／7试剂。定轨振荡器上振荡混合30 sec，室温继续孵育1h，在荧光检测仪中检测荧光信号。

2.8 TUNEL细胞凋亡检测

根据 In Situ Cell Death Detection Kit试剂盒（Roche）说明书操作，步骤如下：CCl4处理细胞 6 h或24 h后，弃培养基，4%多聚甲醛固定细胞 60 min后，加入含 0.1%Triton X-100的 0.1%柠檬酸钠溶液，冰上孵育2 min；加入 TUNEL reaction mixture避光37℃孵育60 min，PBS洗涤细胞后，置于荧光显微镜下观察并拍照。

2.9 统计学分析

实验数据均以均数 ±标准差表示，两组间比较采用 student’t检验。P＜0.05被认为有显著性差异，实验至少重复三次。

结 果

1.Gfer siRNA明显降低 HepG2细胞内 Gfer的表达

将Gfer siRNA和 scramble siRNA分别转染入HepG2细胞，72 h收集细胞，提取细胞总蛋白，并利用 Western Blot方法检测细胞内 Gfer的表达情况。结果显示，与转染scramble siRNA相比，转染 Gfer siRNA后细胞内 Gfer的表达明显降低，下降约60%，具有统计学意义（图1）。说明选择的Gfer siRNA能有效的降低 Gfer的表达，可以应用于后续的实验中。

图1 Gfer siRNA转染 HepG2细胞后 Gfer表达降低，*与scramble组相比，P＜0.05Fig.1 The expression of Gfer is inhibited by Gfer siRNA. *P＜0.05，compared with the scramble-treated group

2.Gfer表达降低增强了CCl4对细胞增殖的抑制作用

将Gfer siRNA和 scramble siRNA分别转染入HepG2细胞，72 h后分别用DMSO或 CCl4处理细胞 6 h和24 h，随后利用 MTS试剂盒检测细胞增殖能力。如图2所示，细胞转染 Gfer siRNA后，即使只加入DMSO，细胞增殖也受到了明显地抑制。CCl4处理6 h后，无论scramble siRNA组还是Gfer siRNA组细胞增殖能力均明显下降，其中 Gfer表达下调后细胞增殖能力抑制则更为明显。CCl4处理24 h后，两组细胞活力进一步下降，尤以 Gfer siRNA组下降更为明显。

图2 Gfer表达降低增强了 CCl4对 HepG2细胞增殖的抑制作用。*P＜0.05Fig.2 The inhibition of Gfer expression potentiate the growth inhibition of HepG2 cells induced by CCl4.*P＜0.05

3.Gfer表达降低加剧 CCl4处理 HepG2细胞后ATP水平的改变

脂溶性的CCl4除可以通过直接膜溶解作用对肝细胞造成损伤外，还可以损伤线粒体，引起线粒体的功能紊乱，影响氧化磷酸化，从而改变细胞内 ATP的水平［11］。细胞转染Gfer siRNA后，与scramble组相比，细胞内 ATP的含量并没有明显的变化（图 3）。CCl4处理6 h后，无论 scramble组还是Gfer siRNA组细胞内的ATP含量均明显增加，但 Gfer siRNA组增加更为明显。而CCl4处理24 h后，两组细胞内 ATP的含量均显著下降，且Gfer siRNA组降低更为明显（图3）。

图3 Gfer表达降低对CCl4处理的HepG2细胞内ATP水平的影响。*P＜0.05，**P＜0.01Fig.3 The effect of decreased Gfer on intracellular ATP level in HepG2 cells after CCl4treatment.*P＜0.05，**P＜0.01

4.Gfer表达降低使CCl4诱导的 HepG2细胞凋亡增加

CCl4对肝细胞的急性损伤，可以诱发细胞凋亡，激活细胞内 Caspase-3。细胞转染 Gfer siRNA后，与scramble组相比，细胞内 Caspase-3活性并没有发生明显的变化（图4）。CCl4处理6 h后，无论 scramble组还是Gfer siRNA组细胞内的 Caspase-3活性均明显增加。而 Gfer siRNA组使Caspase-3活性增加更为明显。CCl4处理24 h后，两组细胞内Caspase-3活性进一步增加，且Gfer siRNA组明显高于 scramble组（图4）。

TUNEL细胞凋亡检测实验中，细胞转染Gfer siRNA后，与 scramble组相比，出现凋亡细胞，但数目较少。而 CCl4处理 24 h后，scramble组及Gfer siRNA组的凋亡细胞数目均有所增多，且Gfer siRNA组的凋亡细胞数显著多于 scramble组（图5）。

图4 Gfer表达降低促进了 CCl4所诱导的 HepG2细胞内Caspase-3活性的增强。*P＜0.05，**P＜0.01Fig.4 Downregulation ofGfer enhance the activation of Caspase-3 in HepG2 cells induced by CCl4.*P＜0.05，**P＜0.01

图5 CCl4处理 HepG2细胞24h后，观察Gfer表达量降低对细胞凋亡的影响Fig.5 The effects of decreased Gfer expression on the HepG2 cells apoptosis intoxicated by CCl4for 24h.A，DMSO＋scramble siRNA；B，DMSO＋Gfer siRNA；C，CCl4＋scramble siRNA；D，CCl4＋Gfer siRNA

讨 论

本实验应用转染siRNA的方法下调细胞内 Gfer的表达。为避免选用的 siRNA发生脱靶现象，我们选择四个具有不同靶序列的 siRNA组合在一起，一同转染入 HepG2细胞，72 h后检测沉默效率。三次不同实验均显示 Gfer siRNA转染后，细胞内的Gfer表达明显下降，说明选择的Gfer siRNA组合有效，可以用于研究Gfer表达下调对细胞的影响。

CCl4可以损伤肝细胞，其损伤机制是 CCl4作用肝细胞后，经肝细胞微粒体细胞色素氧化酶系统代谢、激活后生成 CCl3，CCl3攻击肝细胞膜或激活膜上的磷酸化酶，引起细胞膜和细胞器质膜过氧化损伤［12］。多项研究证实在肝细胞内过表达Gfer后，可通过保护线粒体，避免细胞凋亡，从而保护肝细胞免受 CCl4的损伤。而我们的实验则通过下调Gfer表达，观察 CCl4处理细胞细胞增殖能力、ATP含量和Caspase-3活性。细胞凋亡是细胞消耗ATP的主动死亡形式，当毒物作用于细胞较短时间时，细胞处于凋亡早期阶段，这时细胞内需要大量合成ATP，以诱导并推进细胞完成凋亡［13-14］。但当 CCl4处理细胞24 h后，活细胞数目大量减少，此时细胞内ATP含量明显减少，说明细胞已处于凋亡晚期。证明 Gfer的降低和CCl4类似，同样也是造成细胞损伤的一种因素。有文献报道 Gfer定位于线粒体膜间隙，其可以还原细胞色素 c，具备细胞色素 c还原酶的活性，并参与组成二硫键传递系统来介导蛋白向线粒体膜间腔的转运，可以增加线粒体氧化磷酸化活性［15］。转染 Gfer的肝细胞其抵抗自由基损伤的能力大大提高，这与Gfer保护线粒体功能，稳定线粒体膜电位，抑制细胞线粒体途径的细胞凋亡密切相关［8］。Gfer还可以通过抑制线粒体膜电位通透性转换孔的开放，减少细胞色素C的泄露，上调抗凋亡基因 Bcl-2的表达从而减轻毒性物质对肝细胞的损伤［16］。在本次实验结果中发现降低 Gfer的表达可以加重CCl4对 HepG2细胞的损伤，CCl4诱导的细胞凋亡更为明显。其机制可能和 Gfer的下调导致细胞线粒体功能失调有关，有待我们进一步实验证明。在体内实验中也有文献报道称 Gfer表达降低可以延缓小鼠肝大部分切除术后的肝脏再生以及 CCl4损伤后的肝脏修复［17］，证明 Gfer对肝脏具有重要的保护作用。

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GFER Restrains Injury Induced by CCl4in HepG2 Cells

Gao Jian，Dong Lingyue，An Wei*
（Department of Cell Biology，Municipal Key laboratory for Liver Protection and Regulation of Regeneration，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To explore the effects of downregulation of GFER gene expression on cell injury induced by CCl4in HepG2 cells so as to elucidate the protective effect of GFER on hepatocytes.Methods GFER siRNA was transfected into HepG2 cells for 72 h，and western blot was used to detect the protein level of GFER in order to assess transfection efficiency.After 72 h of GFER siRNA interference，the HepG2 cells were treated with CCl4for 6 h and 24 h.ATP levels and caspase-3 activity were measured.MTS assay was used to measure cell proliferation.TUNEL was used to detect and quantify apoptotic cell death.Results Western blot analysis showed that the protein level of GFER was decreased after GFER siRNA transfectioin.Cell proliferation of HepG2 cells was inhibited by GFER siRNA interference，while the ATP levels and the number of apoptotic cells were both increased after 6 h of CCl4treatment in the siRNA intervention group as compared to the controls.When cells were treated with CCl4for 24 h，proliferation of HepG2 cells was further inhibited after siRNA intervention，and the caspase-3 activity and the number of apoptotic cells were further increased compared to the results obtained at 6 h after CCl4treatment.However，the ATP levels in HepG2 cells were markedly decreased.Conclutsion Downregulation of GFER gene expression aggravates HepG2 cell injury induced by CCl4.

GFER（growth factor Erv1-gene）；CCl4；HepG2；Caspase-3；Apoptosis

R735.7

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.015

2015-07-08

2015-09-28

国家自然科学基金（31371169）

高见，男（1989年），汉族，硕士研究生

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：anwei＠ccmu.edu.cn